Inst. Griselle M. Vargas Morales E-mail: griselle.vargas1@upr.

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1. Familiarizarse con dos tipos de cromatografa utilizadas en la separacin de molculas de diferentes tamaos (aminocidos y protenas). 2. Determinar la composicin de una mezcla de aminocidos. 3. Determinar el grado de afinidad de los aminocidos por medio del clculo de

Tcnica de separacin selectiva de

molculas en donde los componentes de una mezcla compleja pueden ser identificados y/o purificados.
Consiste de una fase mvil y una fase

estacionaria.
1. Cromatografa de capa fina. 2. Cromatografa de columna.

Separar molculas relativamente

pequeas. Azcares simples Lpidos Aminocidos y cadenas cortas de polipptidos Nucletidos Metabolitos Acidos nuclecos.

Fase estacionaria Fase Mvil Depende de las molculas que se El solvente sube por quieran separar. capilaridad, y las muestras se movern segn su afinidad a Puede ser de: Papel, celulosa o gel la fase estacionaria. de silicato unido a una superficie slida. Puede ser: agua, solvente orgnico o mezcla de ambos.

La muestra puede moverse con la

Se analiza por color o luego

fase mvil, viajando una distancia que es inversamente proporcional a la afinidad por la fase estacionaria.

se trata con sustancia desarrolladora (developer).

Relacin entre la distancia recorrida por la muestra y la recorrida por el disolvente en el mismo tiempo RF= h /D Los valores de RF para un determinado compuesto varan ampliamente con los cambios de disolvente y depende de sus caractersticas fisicoqumicas. Medir desde el centro de la mancha.

2. Marque a los bordes de la placa con lpiz NO TOQUE EL SILICATO.

3 . Haga otra marca a 10 cm por encima de la marca inferior.

1. Coloque una placa de silicato sobre la gua plstica.

4. Coloque 2 l de cada muestra individual de aminocidos CUIDADO!!!!!!...... NO MEZCLE LAS MUESTRAS 7. Deje secar en el horno x 5 min. 6. Vuelva y aada 2l 5. Secar en horno la placa de silicato sobre la placa de silicato.

7. Coloque la lamina en el tanque con solvente.

8. Tape el tanque porque

el solvente es bastante
voltil y se evapora con facilidad. 9. Deje que el solvente suba por Capilaridad 10 cm aprox.

CUIDADO!!!!!!...... Solvente a menos de 1 cm de profundidad

10. Secar en horno la placa de silicato x 5 min.

12. Secar hasta que vea las manchas

11. Deje enfriar y roce con ninhidrina.

de colores.

Dibuje o fotografi su placa, identificando cada uno de las muestras.

Distancia recorrida por el solvente: ______cm

Nm ero 1 Nombre de la Muestra Color de la mancha Distanci a recorrida Rf

2
3 4 5

Calcule el Rf de cada muestra estndar y determine cules son los aminocidos en las muestras desconocidas.

Rf = Distancia recorrida por la muestra

Una mezcla de molculas es separada de acuerdo a su afinidad con la Fase estacionaria o con la Fase mvil.
TIPOS DE CROMATOGRAFIA DE COLUMNA: A. Cromatografa de filtracin en gel

B. Cromatografa de Intercambio Inico

C. Cromatografa de Fase Inversa

 Separacin por tamao. Fase estacionaria una gel porosa.

Gel sefadex G-75 con poros pequeos .

Molculas pequeas quedan atrapadas

entre 30,000-70,000 daltons (unidad de masa atmica)

Fase Mvil: Depende del tipo de muestra

Molculas grandes pasan mas rpido por la columna

 Separacin en base a carga

inica
Fase estacionaria tiene una

matriz con carga.

Intercambio catinico: matriz negativa Intercambio aninico: matriz positiva Fase Mvil: Amortiguador a diferentes concentraciones.

Molculas con carga igual a

la fase estacionaria pasarn

K+ Na+ Cl

Moleculas en orden de carga + a -

Para desprender las molculas adheridas en la columna, se utiliza un gradiente de sales (Cloruro de potasio o sodio). Soluciones con diferentes salinidades. 1. Se agrega la solucin de menor concentracin de sal primero. Al subir poco a poco [de sal], podemos recolectar las muestras desde las que poseen menos afinidad por la columna hasta las de mayor afinidad.

Con 1M KCL se lograr separar la protena de inters.

 Separacin Fase

por Afinidad

estacionaria: Fibras de silicato con cadenas de hidrocarburos (hidrofbica). Las molculas polares pasan por toda la columna, mientras que los compuestos hidrofbicos interactan con la fase estacionaria. Las molculas hidroflicas saldrn primero con la fase mvil.
Fase mvil: Solventes orgnicos En nuestro caso se usar isopropanol.

Compuestos polares y no polares

Compuestos no polares retenidos por el filtro

Compuestos polares sin retener

CUIDADO!!!!!!...... lentamente y de 1 ml en 1 ml.. No deje que la columna se Seque.

1. Coloque la columna en forma vertical en el soporte.

2. Abra la columna y quite el tapn inferior.

3. Agregue 3 ml loading buffer (Imidazole 1X) y deje gotear hasta que casi no quede buffer en la parte superior del gel

4. Agregue 300l de la muestra

6. Aada 0.5 ml de loading buffer tratando de no perturbar la superficie, deje gotear. Contine echando buffer hasta que la

5. Deje que la muestra penetre el empaque, hasta que la columna deje de gotear.

6. Recolectar la primera fraccin de color.

7. Recoger el buffer hasta que la siguiente fraccin de color est por salir.

NO DESCARTE LA SEGUNDA FRACCIN: LA NECESITARAN PARA LA SIGUIENTE CROMATOGRAFA.

9. Cuando termine, lave la columna echando 3mL de loading buffer. Sin que se seque la columna. Coloque el

8. Contine eluyendo las fracciones hasta obtener tres fracciones de colores distintos.

Esta columna gotea mucho ms rpido que la de gel.

1. Coloque la columna de CM-celulosa en el soporte y brala para que gotee.

2. Aada la fraccin 2 que guard de la anterior cromatografa.

3. Deje que la muestra penetre el empaque, hasta que la columna deje de gotear.

5. Lave la columna con loading buffer Lquido incoloro.

4. Lave dos veces con 0.5 ml de loading buffer, colocando el primer tubo de ensayo para recolectar la primera banda de

6. Coloque el 4 tubo y eche 10 gotas de elution buffer (Imidazole con KCL). Se supone que el color que esta atrapado en la columna comience a bajar.

7. Aada 0.5mL de elution buffer (Imidazole con KCL). Siga aadiendo elution buffer hasta que salga todo el color de la columna.

8. Cuando termine, lave la columna con 5mL de loading buffer. Tape la columna cuando quede poco buffer.

1. Rotule:

CUIDADO!!!!!!.... .. lentamente 2. Agregue 5 ml de isopropanol al 35% a la jeringa. W 3. Inyecte a travs de la columna al tubo W.

1 3

4. Agregue 5mL de agua. Lave y use la misma jeringa para esto. W

1 6. Agregue 2 ml de agua (debe salir claro).

1 5. 2ml de jugo de uva

2 7. Agregue 3mL de isopropanol al 8%. Recoja las gotas en el tubo 2. Si sigue vindose color rosado en la columna, aada ms.

3 8. Agregue 3mL de isopropanol al 35%. Recoja las gotas en el tubo 3. Contine eluyendo hasta que no se vea ms azul en la columna.

10. Anote los resultados utilizando la leyenda en el pote de los Clinistix.

9. Coloque un Clinistix en las fracciones 1 a 3 para determinar presencia de azcar.