TECNICAS DE MONTAJE

CARACTERISTICAS GENERALES

Las bacterias , junto con los protozoarios, algas microscpicas, hongos
microscpicos (incluyendo levaduras) y virus, constituyen los llamados
microorganismos.

El trmino microorganismos no tiene un significado taxonmico preciso sino
que agrupa a todos los organismos de dimensiones microscpicas (<
0.1mm) aunque presenten grandes diferencias entre si. As por ejemplo
incluye organismos procariotas (bacterias), eucariota (hongos, protozoarios,
algas) y virus.

Tambin difieren notablemente en el tamao aunque sean todos
microscpicos; en una escala comparativa tenemos:
Protozoarios levadura bacterias - virus

BACTERIAS

Aunque existen miles de especies de bacterias diferentes, los organismos individuales
presentan una de las tres formas generales siguiente:
Elipsoidal o esfrica
Cilndrica o en forma de bastn
Espiral o helicoidal

La bacterias esfricas o elipsoidales se denomina COCOS. Muchas bacterias con esta
forma presentan modelos de agrupacin que derivan de los diversos planos de
divisin celular. As tenemos:

Cocos en pares (diplococos)..Ej. Neisseria
Cocos en cadena.Ej. Streptococcus
Cocos en racimo..Ej. Staphylococcus
Cocos en ttradasEj. Pediococcus
Cocos en cubo.Ej. Sarcina
Cocos sin distribucin especial



Las clulas bacterianas cilndricas se denominan BACILOS o
BASTONES y presentan otros modelos de agrupacin.

As tenemos:
Bacilos en cadenaEj Bacillus
Bacilos en empalizadasEj. Corynebacterium
Bacilos sin distribucin especial

Las bacterias helicoidales se presentan en general como clulas
individuales, independientes; pero las clulas de las distintas
especies presentan notables diferencias de longitud, nmero
y amplitud de las espiras y rigidez de la pared.

CLASIFICACION
PRINCIPALES CARACTERISTICAS DE LOS MICROORGANISMOS
Para proceder a identificar y clasificar a un macroorganismo, deben
determinarse, con cierto grado de precisin, las caractersticas del
mismo. Entre ellas, las principales son las siguientes:

Caractersticas de Cultivo: las sustancias nutritivas necesarias para el
desarrollo y las condiciones fsicas de un medios que lo favorezcan .

Caractersticas morfolgicas: el tamao de las clulas, su forma de
agrupacin, diferenciacin en tintura e identificacin de estructuras.

Caractersticas metablicas: la manera por la cual los microorganismos llevan
a cabo los procesos qumicos biolgicos
Caractersticas de la composicin bioqumica: la
identificacin de las principales caractersticas de
los componentes qumicos de la clula.

Caractersticas antignicas: la deteccin de
componentes celulares especiales (qumicos) que
dan prueba de similitud entre las especies.

Caractersticas genticas: el anlisis de la composicin
del acido desoxirribonucleico (ADN) as como la
determinacin de la reaccin que ocurre entre
material ADN a partir de diferentes
microorganismos.
Taxonoma, nomenclatura y clasificacin
Taxonomia es un termino que se relaciona con la Sistemtica, y se refiere a la
clasificacin o agrupamiento sistemtico de los organismos en
grupos o categoras llamados taxa.

La taxonoma se divide en tres partes:
Clasificacin: el agrupamiento ordenado de unidades en grupos dentro de
unidades mayores.

Nomenclatura: la denominacin de las unidades definidas (caractersticas) y
por la clasificacin.

Identificacin: Haciendo uso del criterio establecido por la clasificacin y
nomenclatura mencionados, los microorganismos se identifican
comparando las caractersticas de las unidades desconocidas y las
conocidas.

PRINCIPIOS DE NOMENCLATURA
Los cdigos zoolgicos, botnicos y bacteriolgico se basan en determinados
principios comunes; algunos de los mas importantes son los siguientes:

Cada clase distinta de organismos se designa como una especie.

Las especies se nombran por vocablos latinos para ajustarse a una denominacin
internacional caracterstica (sistema binominal de nomenclatura)

La aplicacin de los nombres esta reglamentada.

Una ley de prioridad asegura el uso del nombre legitimo mas antiguo disponible.

Se requiere la designacin de categoras para clasificar los organismos.

Se establecen criterios para la publicacin efectiva de nuevos nombres especficos, as
como una gua para acuar los nuevos.


NOMBRES CIENTIFICOS DE LAS BACTERIAS
Las bacterias de cada clase distinta se reconoce como una especie (plural
especies).

Segn el sistema binomial de nomenclatura, cada especie recibe un nombre
formado de dos palabras, por ejemplo, Bacillus subtilis.

La primera palabra del nombre es el gnero (plural gneros) y siempre se
escribe con mayscula.

La terminacin del nombre genrico gramatical de la especie debe concordar
con l y siempre con bastardilla.
Ejemplos:
Bacillus (masculino): bastoncito
Lactobacillus (masculino): bastoncito de la leche
Sarcina (femenino): paquete o manojo

Algunos ejemplo de gneros bacterianos de origen griego
alterado para uso latino son:

Micrococcus (masculino): grano pequeo
Clostridium (neutro): un huso pequeo.
Corynebacterium (neutro): bastoncito en masa.

Ejemplos de gneros bacterianos asignados en honor de
personas y latinizados son:

Pasteurella (femenino): por Louis Pasteur
Erwinia (femenino): por Edwin F.Smith, precursor de la
patologa de las plantas en Amrica.
Neisseria (femenino): por Albert Neisser, descubri el
microorganismo que causa la gonorrea.
La segunda palabra del nombre de una bacteria se escribe con letra minsculas y suele
ser descriptivo.
Un adjetivo que modifica al nombre: Staphylococcus albus (Estafilicoco blanco).

Un adjetivo en forma de participio activo de un verbo: Clostridium dissolvens
(Clostridio disolvente).

Un nombre en posesivo que modifica el nombre genrico: Samonella pullorum (
Salmonela de los pollos)

Un nombre en oposicin, un nombre explicativo: Bacillus radicicola (Bacilos que habita
en la raz)

Se puede aadir el autor del nombre de la bacteria, como en Bacillus coagulans
(Hammer)

En ocasiones es conveniente subdividir una especie en variedades, como en el caso de
que haya diferencias reconocidas dentro de las clasificacin en una nueva
especie. Una cepa de Srteptococcus lactis que produce un sabor de malta se
designa Srteptococcus lactisvar. maltigenes
NOMBRE COMUNES DE LAS BACTERIAS
Gonococo....Neisseria gonorrhoeae

Bacilo tuberculoso..Mycobacterium tuberculosis

Bacilo diftrico.Corynebacterium diphteriae

Bacilo tfico.Salmonella typhi
METODO DE DIAGNOSTICO
Los mtodos de diagnstico empleado en
cualquiera de las ramas de la bacteriologa,
virologca, micologa, protozoologa o
helmintologa pueden ser agrupados en dos
grandes grupos que son los mtodos de
diagnostico directo y los mtodos de
diagnostico indirecto.
METODOS DE DIAGNOSTICO DIRECTO
Son procedimientos que permiten demostrar la presencia del
agente infeccioso en cualquiera de sus etapas morfolgicas.
Estos dos mtodos pueden ser:
1. Macroscpicos: solo se utilizan para el diagnstico de
vermes adultos y artrpodos.
2. Microscpicos: comprende cualquiera de los exmenes
hecho con la ayuda del microscopio sea en materiales
frescos o coloreados.
3. Cultivo: son ms usados en los captulos de bacterias y de
hongos. Permiten aumentar el nmero de grmenes
cuando ellos son muy escasos y estudiar adems sus
propiedades culturales y bioqumicas.
4. Inoculaciones: pueden ser a veces los
procedimientos ms fciles o ms rpidos
para lograr el diagnstico de algunos agentes
infecciosos.
5. Estudios Histopatolgico: el material se
obtiene por puncin, biopsia o necropsia.
6. Xenodiagnstico: se utiliza, por ejemplo, en
diagnstico de Tripanosoma cruz.
METODOS DE DIAGNOSTICO INDIRECTO
Son procedimientos que no muestran en ningn momento el agente que se
investiga, sino las reacciones que producen en el organismo atacado. Los
mtodos pueden ser especficos e inespecficos.
Inespecficos: el hemograma y la eritrosedimentacion proporcionan datos de
mucho valor presuntivo en el diagnostico de determinadas enfermedades.
Especficos: se basan en el estudio de las reacciones celulares y humorales
inmunolgicas, pueden diagnosticar en forma directa el agente que las
ocasiono.
Los procedimientos especficos pueden ser: pruebas inmunoalrgicas que
utilizan antgenos bacterianos totales o fraccionados, para detectar
especialmente inmunidad celular
y pruebas serolgicas basadas en fenmenos que demuestran la unin
especifica del antgeno con el anticuerpo (Fijacin de complemento
hemaglutinacion, lisis, precipitacin, inmunofluorescencia, neutralizacin
de virulencia, radioinmunoensayo, ELISA, ETC.)
EXAMEN EN FRESCO
Las preparaciones en fresco son preferibles en las situaciones
siguientes:
1. La morfologa de las bacterias en espiral se altera mucho
cuando se desacan y tien; deben, por lo tanto, examinarse
en estado vivo.
2. Cuando las bacterias se observan para determinar si o no
mviles.
3. Para observar los cambios citolgicos que ocurren durante
la divisin celular y determinar la velocidad en que
ocurren.
4. Por este mtodo se observan fcilmente algunas inclusiones
celulares como vacuolas y materias grasa.
PREPARADOS FIJOS Y TEIDOS
Para observar las caractersticas morfolgicas de las bacterias, las
preparaciones fijas y teidas son las que se usan con mayor
frecuencia.
a) Las clulas son visibles mas claramente despus de teidas
y
b) En las preparaciones teidas las diferencias entre clulas de
especie diferentes y dentro de la misma especie se
demuestra mediante soluciones colorantes apropiadas
(tincin diferencial o selectiva).
Los pasos esenciales en la preparacin de un fijo y teido son:
a) Hacer el frotis o pelcula
b) La fijacin y
c) La aplicacin de una o ms soluciones colorantes.
Fijacin

Las clulas teidas que se observan con un microscopio
deben parecerse la mas posible a las clulas vivas.
La fijacin es el proceso por el cual se conservan y fijan
en su posicin las estructuras internas y externas de
las clulas de los microorganismos.
Inactiva enzimas que podran alterar las morfologa
celular y endurece las estructuras celulares, de
manera que no cambian durante la tincin ni la
observacin.
Normalmente, durante la fijacin se mata al
microorganismos y se fija firmemente al
portaobjetos.
Fundamentalmente, existen dos clases de fijacin diferencial:
1. Los bacterilogos fijan con calor frotis bacterianos
calentando suavemente a la llama una pelcula de bacterias
secada previamente al aire. Este mtodo conserva
adecuadamente la morfologa general, pero ni las
estructuras internas de la clula.
2. Sin embargo, para proteger las subestructura fina y la
morfologa de microorganismo delicados de mayor tamao
hay que utilizar la fijacin qumica. Los fijadores qumicos
penetran en las clulas y reaccionan con componentes
celulares, normalmente protenas y lpidos, para inactivarlos
y convertirlos en insolubles e inmviles.

COLORANTES MICROBIOLGICAS
Los numerosos tipos de colorantes empleados para teir microorganismos
poseen dos caractersticas en comn:
Todos poseen grupos cromforos , grupos con dobles enlaces conjugados que
dan el color al colorante.
Pueden unirse a las clulas mediante enlace inicos, covalentes o hidrfobo.
Por ejemplo, un colorante cargado positivamente se une a estructuras
cargadas negativamente de la clula.
Los colorantes ionizables se pueden dividir en dos clases generales, tomando
como base la naturaleza de su grupo cargado.
Los colorantes bsicos- azul de metileno, fucsina bsica, cristal violeta,
safranina, verde malaquita- son cationicos o tiene grupos cargados
positivamente y se comercializan generalmente como sales de cloruro.
Los colorantes bsicos se unen a molculas cargadas
negativamente, como cidos nucleicos y muchas
protenas.
Como las superficies de las clulas bacterianas estn
cargadas negativamente, estos colorantes se
emplean a menudo en bacteriologa.
Los colorantes cidos- eosina, rosa de bengala y fucsina
acida- son aninicos o poseen grupos cargados
negativamente.
Los colorantes cidos, debido a su carga negativa, se
unen a estructuras celulares cargadas
positivamente.
El pH puede modificar eficazmente la tincin, pues la
naturaleza y el grado de la carga de los componente
celulares cambian con el mismo.
Los colorantes aninicos tien mejor en condiciones
acidas, en que las protenas y muchas otras
molculas poseen una carga positiva;
los colorantes bsicos son mas eficaces a valores de pH
mas elevados.
Para realizar los exmenes microscpicos
(biopsia) es necesario someter el material
en estudio a procedimientos especiales
cuyo conjunto constituye la denominada:
Tcnica Histolgica
Montaje
Inclusin
Fijacin Mediato (post mortem)
Inmediato (in vivo)
Microtoma
Mtodos de examen
Tincin
Fijacin
Son generalmente
sustancias qumicas que
coagulan o precipitan los
prtidos celulares,
endurecen los tejidos y
facilitan el tratamiento
posterior al que sern
sometidos.
Ejemplos: Formalina,
Bouin, ALFAC, etc.
24 horas
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Fijacin Toma de muestra
Histoprocesamiento
Consiste en un proceso de
deshidratacin progresiva
con el fin de preparar la
muestra (tejido) para la
inclusin final.
OH96
OH96
OH70
OH70
OH 50 parafina2
parafina1
Xilol2
Xilol1
OH100
OH100
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Inclusin Final
Una vez finalizado el
histoprocesamiento se
procede a la formacin
del bloque de parafina u
otro medio de inclusin
en diferentes tipos de
moldes:
- Barras de Leuckart -
Cassette
- Molde de papel.
Tejido
Parafina Histolgica
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Microtoma
Los micrtomos son
aparatos que permiten
efectuar en forma
mecnica cortes
histolgicos muy finos
para que los rayos
luminosos puedan
atravesarlos y ser
observados al
microscopio, de modo
que los constituyentes
estn en un solo plano.
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Tincin
Es el proceso mediante el
cual un cuerpo toma
color por la accin de una
sustancia colorante y no
se destie con un lavado
efectuado con el solvente
empleado para preparar
la solucin colorante.
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Montaje
El objetivo de este paso
es cubrir el corte
histolgico con un
cubreobjeto y dejarlo
ptimo para su
visualizacin
microscpica.
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Porta objeto
Muestra
Microscopa
El Microscopio es un
instrumento de ptica
que permite ver de cerca,
y aumentados, objetos
pequeos o detalles
estructurales
imperceptibles a simple
vista.
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Microscopa ptica(2)
Procesado de la muestra biolgica
para su adecuada observacin
1. Obtencin de la muestra
2. Fijacin
3. Inclusin
4. Corte
5. Tincin
6. Montaje
Procesamiento de la muestra:
Permitir que la luz la atraviese y podamos observarla
Mantener condiciones cercanas a las naturales

Pasos a seguir
OBTENCIN RECOGIDA DE LA MUESTRA
Lo ms rpida posible para evitar procesos de descomposicin
Evitar:
Autolisis por liberacin de enzimas lisosomales (ms rpida)
Putrefaccin provocada por enzimas bacterianos (ms tarda)
FIJACIN
Agentes fijadores
Capacidad fijadora (evitan autolisis)
Capacidad conservante (evitan putrefaccin)


Evitan la aparicin de alteraciones tras la muerte (autolisis y
putrefaccin)

Fsicos
Congelacin:
N2 lquido (-121C)
Isopentano (-50C)
Criodesecacin o liofilizacin (desecacin por sublimacin)
Criosustitucin (alcohol etlico, acetona o polietilenglicol)


Qumicos: desnaturalizacin o precipitacin de protenas
TIPOS DE FIJADORES
Bloqueo de la autolisis.
Efecto microbicida.
Evitar los efectos osmticos.
Evitar los cambios de textura y composicin tisular.
Efecto mordiente.
TIPOS DE FIJADORES QUMICOS
Fijadores por deshidratacin tisular (disuelven las grasas): alcohol
etlico, metanol, acetona

Fijadores por cambio en el estado coloidal de las protenas
(disminucin de PH por debajo del PI):
cido actico, cido tricloroactico y cido crmico

Fijadores que actan formando sales en los tejidos

Fijadores que actan por reticularizacin de las protenas

Mezclas fijadoras
INCLUSIN
Deshidratacin previa
mediante fijacin en alcohol
en gradacin ascendente y
su
Aclarado posterior
Sustancias que producen un endurecimiento de la muestra
para su corte adecuado
PARAFINA
CORTE
CORTE
TINCIN
Colorantes bsicos: colorean estructuras cidas
Colorantes cidos: colorean estructuras bsicas
Colorantes neutros: colorean estructuras diversas
Colorantes indiferentes: colorean por impregnacin fsica
Colorantes metacromticos: tien de color diferente al del colorante
Segn grupos cromforos:
Segn criterios de especificidad
General
Especfica: colorean estructuras concretas
TINCIN
TINCIN GENERAL Y TINCIN ESPECFICA
Tincin Hematoxilina-Eosina
Tincin de Plata. Tejido nervioso
TINCIN GENERAL Y TINCIN ESPECFICA
Tincin de Mallory. Colgeno
TINCIN GENERAL Y TINCIN ESPECFICA
ALMACENAMIENTO
Preparacin y Tincin de las muestras
Aunque los microorganismos vivos se pueden
examinar directamente con un
microorganismos ptico, a menudo hay que
fijarnos y teirlos para aumentar la resolucin,
acentuar las caractersticas morfolgicas y
conservarlos para su estudio en el futuro.
TINCION SIMPLE
Los microorganismos se pueden teir
satisfactoriamente mediante Tincin Simple, esto es,
utilizando solo un colorante.
El valor de esta clase de tincin radica en su simplicidad
y facilidad de empleo.
El frotis, previamente fijado, se cubre con un colorante
durante el tiempo adecuado, se lava el exceso de
colorante con agua y se seca el portaobjetos.
Los colorante es bsicos como cristal violeta, azul de
metileno y carbolfucsina se emplea con frecuencia
para determinar el tamao, la forma y la
organizacin de las bacterias.

TINCION DIFERENCIAL
En el primer paso de esta tincin, se tie con el colorante bsico cristal violeta
(violeta de genciana), el colorante primario. A continuacin, se trata con
una solucin yodada que acta como mordiente.

Esto es, el yodo aumenta la interaccin entre la clula y el colorante, de forma
que aquella se tie ms intensamente.

Luego se decolora el frotis lavndolo con etanol o acetona. Este paso produce
el aspecto diferencial de la tincin de Gram; las bacterias Gram positivas
retienen el cristal violeta, mientras que las Gram negativas lo pierden y
aparecen incoloras.

Finalmente, el frotis se tie de nuevo con un colorante bsico de diferente
color al cristal violeta.
La safranina es el colorante de contraste ms comn y tien las bacterias
Gram negativas de rosa o rojo, dejando a las Gram positivas de color
violeta.
La tincin de acido- alcohol resistencia es otro mtodo
importante de tincin diferencial. Unas pocas especies,
particularmente Mycobacterium no se unen fcilmente a
colorantes simples y hay que teirlas con un tratamiento ms
fuerte: calentando una mezcla de fucsina bsica y fenol.
Una vez que la fucsina bsica ha penetrado en la cella con la
ayuda del calor y el fenol, las clulas acido-alcohol resistentes
no se decoloran fcilmente con una solucin acidoalcohlica,
permaneciendo de color rojo.
Esto se debe al elevado contenido en lpidos de las paredes de
estas clulas; en partculas, los cidos miclicos, los
responsables de la propiedad de cido- alcohol resistencia.
Las bacterias no cido-alcohol resistentes se
decoloran con la solucin acidoalcoholico, por
lo que se tien de azul con azul de metileno
(tincin de contraste).
Este mtodo se emplea para identificar
Mycobacterium tuberculosis y M.Leprae.,
agente patogenos responsables de la
tuberculosis y la lepra.

TINCION DE ESTRUCTURAS ESPECIFICAS
Uno de los mas sencillos es la tincin negativa, tcnica
que revela la presencia de cpsulas difusa alrededor
de muchas bacterias.
Se mezcla las bacterias con tinta china o colorante de
nigrosina y se extienden en una capa fina sobre el
portaobjetos.
Despus de secarlo al aire, las bacterias aparecen como
cuerpos ms claros en medio de un fondo azul
oscuro, porque la tinta y las partculas de colorantes
no pueden penetrar ni la clula bacteriana ni su
cpsula.

La extensin de la regin de luz est
determinada por el tamao de la cpsula y por
la propia clula. Apenas se produce
modificacin de la forma bacteriana y la clula
se puede teir posteriormente para conseguir
una mejor visibilidad.
Las bacterias de los gneros Bacillus y Clostridium forman una estructura de
supervivencia en condiciones ambientales desfavorables,
excepcionalmente resistentes durante periodos largos de tiempo. Esta
estructura se denomina endospora pues se desarrolla dentro de la clula.
La morfologa y la localizacin de las esdosporas varan con la especie y
son a menudo de un gran valor para la identificacin bacteriana; pueden
ser esfricas a elpticas, con un dimetro menor o superior al de la
bacteria madre.
Se puede observar con el microscopio de contraste de fases o mediante
tincin negativa. Las endosporas no se tien bien o mediante tincin
negativa. Las endoporas no se tien bien con la mayora de los colorantes,
pero una vez teidos, resisten intensamente la decoloracin. Esta
propiedad es la base de la mayora de los mtodos de Tincin de
endosporas..
Con el metodo de Schaeffer-Fulton, las endosporas se tien
primero calentando las bacterias con verde malaquita, la
preparacin con agua para eliminar el resto de colorante y se
contratie con safranina. Esta tcnica revela endosporas de
color rosa a rojo

TINCION DE FLAGELOS
Los flagelos son estructuras de locomocin en forma de hilo, tan
delgados que slo se pueden observar directamente con el
microscopio electrnico.
Para observarlos con el M. optico, se aumenta su grosor
cubrindolos con mordientes, como cido tnico y alumbre de
potasio, y tindolos con pararosanilina o fucsina bsica.
Los mtodos de tincin de flagelos ofrecen una informacin
taxonmica importante acerca de su presencia y el modelo de
su distribucin.