Universidade Federal de Sergipe UFS

Centro de Cincias Exatas e Tecnologia - CCET

Departamento de Engenharia Qumica
Crescimento Microbiano

MEIOS DE CULTURA
MEIO DE CULTURA

MEIO DE CULTURA: material nutriente preparado
no laboratrio para o crescimento de
microrganismos.

CULTURA: microrganismos que crescem e se
multiplicam no meio de cultura.

MEIO DEFINIDO: TODA A COMPOSIO QUMICA
CONHECIDA

MEIO COMPLEXO: COMPOSIO QUMICA NO
CONHECIDA (composto por nutrientes como extrato
de levedura, de carne ou de plantas)

MEIO DE CULTURA

MEIO DE CULTIVO SELETIVO E DIFERENCIAL:

- Meio seletivo: favorece o crescimento de uma determinada bactria de
interesse, impedindo o crescimento de outras bactrias.
Ex: gar Sabouraud dextrose, pH 5,6, utilizado no crescimento de fungos que so
favorecidos, em relao as bactrias, pelo baixo pH.

- Meio diferencial: facilita a identificao de um determinado organismo.
Ex: meio gar-sangue, utilizado para a identificao de bactrias capazes de
destruir clulas sangneas (anel claro em torno da colnia).
MEIO DE CULTURA

MEIO DE ENRIQUECIMENTO:

Favorece o desenvolvimento de uma populao bacteriana que esta em
desvantagem entre outras populaes.


MEIOS REDUTORES:

Meios com reagentes, como o Tioglicolato de Sdio, que capaz de se
combinar com o oxignio dissolvido eliminando este elemento do meio de cultura
(especfico para microrganismos anaerbicos).
2- Elementos Qumicos como nutrientes
Todos os organismos necessitam de uma variedade de elementos qumicos como
nutrientes;

Necessrios tanto para a sntese como para as funes normais dos
componentes celulares;

Elementos qumicos principais: carbono, nitrognio, enxofre, fsforo e outros
elementos.
Carbono
O carbono forma o esqueleto das trs maiores classes de nutrientes orgnicos:
carboidratos, lipdeos e as protenas fornecem energia para o crescimento
da clula e servem como unidade bsica do material celular.
Microrganismos que utilizam compostos orgnicos como sua principal fonte de
carbono heterotrficos ( obtm as molculas orgnicas absorvendo-as a
partir do meio)
Microrganismos que utilizam dixido de carbono como sua principal ou nica
fonte de carbono autotrficos
2- Elementos Qumicos como nutrientes
Nitrognio

tambm necessrio para a sntese de compostos indispensveis clula, a
exemplo das protenas.
Algumas bactrias necessitam de fontes orgnicas de nitrognio como
aminocidos ou sais orgnicos de amnio, enquanto outras so capazes de
utilizar fontes inorgnicas de nitrognio como nitratos, amnia ou o prprio
nitrognio atmosfrico.
Enxofre e Fsforo

Enxofre necessrio para a biosntese de alguns aminocidos

Fsforo essencial para a sntese de cidos nuclicos e adenosina trifosfato
(ATP) composto importante para o armazenamento e a transferncia de
energia
Outros elementos essenciais so requeridos. Estes podem facilitar o transporte
de materiais atravs das membranas celulares
2.1- Meios de cultivo
Meios Utilizados para o Cultivo de Microrganismos

Os componentes comuns na estrutura do meio faro parte de uma destas categorias :

nutrientes nitrognio-amnico - peptonas, infuses, extratos .....

fonte de energia - glicose ....

fatores de promoo de crescimento - sangue, soro, vitaminas, NADH ....

tampo fosfato, para manuteno de pH em meios de fermentao - sais de fosfato
acetatos e citratos solveis

sais minerais e metais, para melhorar o crescimento - PO
4
-2
, SO
4
-2
, Ca
+2
, Mg
+2
, Fe
+2
, Mn
+2
e
metais

agentes seletivos - reagentes qumicos, antibiticos e tinturas inibidoras

corantes indicadores, teis para indicar mudanas de pH no meio, durante e depois do
crescimento de microrganismos - fenol vermelho, vermelho neutro, bromocresol prpura ....

agentes gelificantes - gar, gelatina ....
Meios p/ cultivo de Bactrias

Normalmente imitam o hbitat normal das
mesmas.

Para as bactrias que preferem os nutrientes
encontrados no sangue, adiciona-se sangue ao
meio.
Meios p/ cultivo de Bactrias
Se a glicose o constituinte comum de um
nicho bacteriano, adiciona-se o acar ao
meio.

Para as que apresentam maiores exigncias
nutricionais (fastidiosas), utiliza-se os meios
complexos, os quais contm uma grande
variedade de substncias orgnicas.

Meios p/ cultivo de Fungos

Essa absoro auxiliada por enzimas que quebram as
molculas orgnicas;

Todos os fungos so heterotrficos, e podem crescer
no laboratrio:
Em uma mistura simples contendo acar, uma
fonte de nitrognio inorgnico ou orgnico e alguns
minerais;
Meios p/ cultivo de Fungos
Alguns necessitam de vitaminas;
Outros podem crescer somente em meio complexo que
contenha uma grande variedade de compostos orgnicos
providos da peptona e extrato de carne;
Em geral, o meio para cultivo de fungos tem:

Um pH menor: 3,8 a 5,6.
Composio de um meio utilizado para o isolamento e
crescimento de fungos em geral
gar Sabourand:
Fonte de carbono, nitrognio: peptona
Fonte de carbono e energia: glicose (em alta
concentrao, inibe o crescimento bacteriano)
Agente solidificante: gar
Solvente: H
2
O
Meios p/ Cultivo de Algas
Algas utilizam luz para produzir energia;
Requerem CO
2
, H
2
O e vrios ons inorgnicos
para crescer;
Meios complexos geralmente contem extrato
de soja;
Existem poucos meios prontos, como para
bactrias e fungos.
Diferencia-se os meios:
1. Pela Consistncia:
Lquidos:
No contm gar. Ex.: Caldo simples.

Fluidos:
A percentagem de gar inferior a 0,1%.
Ex.: Meio de Tioglicolato.

Semi-slidos:
Participao de 0,3-0,5% de gar.
Ex.: Meio de Sim, Cary & Blair.
Solidificados:
So meios de cultura que apesar de slidos,
podem ser liquefeitos. Usualmente contm
1,5-2% de gar.
Ex.: gar-simples, gar-sangue.

Slidos:
Aqueles que embora no contenham gar,
apresentam-se naturalmente no estado
slido. Ex.: Fatias de batata, usadas
ocasionalmente para cultivo de bactrias.
2. Pela procedncia:
Naturais:
Aqueles que no sofrem alterao de sua
composio. Ex.: Batata, Cenoura, leite, suco
de laranja.

Artificiais:
So preparados pela mistura de diversas
substncias. Ex.: gar simples, gar
chocolate, gar Mueller-Hilton.

3- Condies fsicas para o cultivo dos microrganismos
O meio fsico apropriado deve ser fornecido para um crescimento timo.
As condies principais que influenciam o meio fsico de um
microrganismo so:
A medida que h um aumento da temperatura, as reaes qumicas e enzimticas
na clula tendem a tornar-se mais rpidas, acelerando a taxa de crescimento.
Entretanto, em determinadas temperaturas inicia-se o processo de desnaturao de
protenas e cidos nuclicos, inviabilizando a sobrevivncia celular.

Assim, todos os microrganismos apresentam uma faixa de temperatura onde
desenvolvem-se plenamente. Nesta faixa de temperatura podemos determinar as
temperaturas mnima, tima e mxima (temperaturas cardeais), para cada
microrganismo.
Temperatura
Temperaturas cardeais dos microrganismos
3- Condies fsicas para o cultivo dos microrganismos
Dentre os diferentes microrganismos observa-se uma ampla variedade de
faixas de temperatura. Assim, os microrganismos podem ser classificados
em quatro grupos, de acordo com os timos de temperatura:

psicrfilos (0 a 10C, timo de 5C) - Na rea de alimentos: no causam
problemas na preservao de alimentos

mesfilos (20 a 40C, 37C - E. coli). Na rea de alimentos: degradam
alimentos e so patognicos

termfilos (50 a 68C, 62C ), compostagem e

hipertermfilos (80 a 113C, 105C) - So encontrados nos solos, silagem,
fontes termais e no fundo ocenico.
3- Condies fsicas para o cultivo dos microrganismos
pH
O pH timo normalmente bem definido para cada espcie.
Quando os microrganismos em crescimento ativo so cultivados em um meio
de cultura, o pH do meio sofrer alterao medida que os compostos cidos
ou alcalinos so produzidos. Esta mudana pode inibir o crescimento
posterior, tais variaes podem ser prevenidas pela adio de um tampo.
pH = - log {H
+
}. Quanto > {H
+
}, < pH, e mais cido
3- Condies fsicas para o cultivo dos microrganismos
Atmosfera
Alguns gases so utilizados no metabolismo celular. O O
2
e CO
2
, so os dois gases
principais que afetam o crescimento de clulas microbianas.
De acordo com a resposta ao O
2
os microrganismos so divididos em 4 grupos
Aerbios - requerem oxignio para o crescimento
Se os microrganismos crescem em meio lquido podem rapidamente utilizar o O
2

dissolvido na camada superficial do meio. Para evitar este problema, as culturas
lquidas de microrganismos aerbios so algumas vezes agitadas para aumentar o
suprimento de O
2
dissolvido
3- Condies fsicas para o cultivo dos microrganismos
Facultativos - crescem na presena de O
2
ou podem tambm crescer em
anaerobiose quando em condies de anaerobiose, obtm energia pelo processo
metablico chamado fermentao. Ex. genros da famlia bacteriana
Enterobacteriacea (Escherichia coli), leveduras (Saccharomyces cerevisae)
Anaerbios - no utilizam o O
2
para reaes de produo de energia
Microaerfilos - podem utilizar oxignio nas reaes qumicas para a produo
de energia. No suportam nveis de O
2
presentes na atmosfera, como requerem
os aerbios, mais podem utilizar o O
2
em nveis mais baixos.
Presso Osmtica
Meios de cultura com presses osmticas inferiores s do interior do
microrganismo, no afetam sua viabilidade, uma vez que a rigidez da parede
celular impede a entrada excessiva de gua;

Meios de cultura com presses osmticas mais elevadas que a encontrada no
interior do microrganismo causam perda de gua intracelular, podendo ter
efeito bactericida.
3- Condies fsicas para o cultivo dos microrganismos
IMPORTANCIA DE ESTUDAR O CRESCIMENTO MICROBIANO

Quando os microrganismos so desejveis:
-produo de compostos de interesse
-Melhoria de processos de produo

Quando microrganismos so indesejveis:
- patgenos
- deteriorantes
Favorecer a inibio e eliminao
O controle do meio no qual os microrganismos crescem pode
ser utilizado para fazer identificaes das espcies e para medir o
crescimento microbiano.
O cultivo de microrganismos requer meios de cultura
apropriados.
CRESCIMENTO DAS CULTURAS BACTERIANAS
DIVISO BACTERIANA:


considerado o aumento do nmero de indivduos e no do tamanho celular.

1. BROTAMENTO: < n de bactrias (forma um broto que quando atinge o
tamanho da clula parental se separa)


2. FISSO BINRIA:

(1) alongamento da clula e a replicao do DNA cromossomal;
(2) incio da invaginao da parede celular e da membrana plasmtica;
(3) em um determinado momento, as duas sees da parede celular de
encontram;
(4) produo de duas clulas individuais idnticas clula me.
Fisso Binria
Figura 6. Fisso binria bacteriana.
(Adaptado de Tortora, G.J., et al., Microbiology,2003)
4- Crescimento exponencial ou em progresso geomtrica
Considerando crescimento populao de bactrias:

1



2 2
1


4 2
2


Crescimento exponencial ou em
progresso geomtrica
n = nmero de geraes
8 2
3
2
n

4.1- Tempo de gerao (g ou G): o intervalo de tempo necessrio para que uma
clula se divida ou para que a populao duplique.
Bacteria Meio Tempo de gerao (minutos)
Escherichia coli

Glicose-sais 17
Bacillus megaterium Sacarose-sais 25
Streptococcus lactis Leite 26
Streptococcus lactis

Caldo lactosado 48
Staphylococcus aureus

BHI 27-30
Lactobacillus acidophilus

Leite 66-87
Rhizobium japonicum

Meio Manitol 344-461
Mycobacterium tuberculosis Sinttico 792-932
Crescimento microbiano
A diviso da clula precedida de aumento da massa celular, pela
sntese de protenas, polissacardeos, lipdeos e cidos nuclicos que a
constituem. A sntese destes componentes s possvel se o
microrganismo tiver acesso a nutrientes que forneam os elementos
bsicos necessrios.

O crescimento de microrganismos em meios lquidos causa a turvao
do meio, denominando-se ento de cultura microbiana a esta
populao de microrganismos distribudos no meio;

O crescimento de microrganismos em meio slido permite a obteno
de colnias de microrganismos. Cada colnia constitui uma populao
bacteriana, originada por divises sucessivas de um microrganismo.
4.2- Expresses matemticas de crescimento
Os valores de crescimento permitem predizer e controlar a quantidade de
crescimento de qualquer espcie microbiana unicelular.
O crescimento de uma espcie unicelular em cultura pode ser
caracterizado em termos quantitativos. Isto inclui o nmero de geraes
que se tem desenvolvido em um perodo de incubao, bem como o
tempo de gerao e a taxa de crescimento (nmero de geraes por hora);
Populao Total (N)

(1) N= 1x 2
n
mas o n inicial clulas inoculadas no tempo zero >1 ento:
(2) N= No x 2
n
onde:
N= nmero final de clulas
No= nmero inicial de clulas
n= nmero de geraes
Aplicando logaritmo (log):
(3) log N= log No + n log 2
n = log N - logNo / log 2
n = log N - log No / 0,301
(4) n = 3,3 (log N-log No)
4.2- Expresses matemticas de crescimento
A partir da equao (4) possvel calcular o nmero de geraes (n) que
ocorreram em uma cultura se o n inicial e final de clulas for conhecido.
Tendo-se o valor de n pode-se calcular o tempo de gerao (g)
(5) g = t/n

Exemplo:
Calcular o tempo de gerao de uma cultura cuja populao celular passa de 10
3
para 10
8
aps 5 horas de cultivo
(4) n = 3,3 (log N-log No)
n = 3,3 (log 10
8
- log 10
3
) ----> n = 3,3 (8-3) = 16,5 geraes
g = 5 / 16,5 = 0,3 horas
Tempo para duplicar a populao celular foi de 0,3 horas.
Taxa de crescimento ou velocidade de crescimento R: nmero de geraes por
unidade de tempo.
R = 1/g (h
-1
) ou R = n/t
Se g = 0,3 horas ento R = 1/0,3 = 3,3 geraes/h
4.2- Expresses matemticas de crescimento
5- Curva de crescimento microbiano (cultura descontnua)
Quando uma cultura microbiana desenvolve-se em um sistema
fechado, pode-se confeccionar uma curva de crescimento. Esta pode
ser dividida em diferentes etapas: lag, log, estacionria e de declnio.
5- Curva de crescimento microbiano
Fase de crescimento Taxa de crescimento Caractersticas
Lag ou adaptao zero Nenhum aumento no nmero de clulas,
aumentam de tamanho, so sintetizadas novas
enzimas para as clulas se adaptarem ao novo
meio
Exponencial ou Log mxima ou constante Condies de crescimento balanceado; as clulas
so uniformes em termos de composio
qumica e atividade metablicas e fisiolgicas.
Pico da atividade e eficincia fisiolgica
Estacionria zero Algumas clulas morrem, outras crescem e se
dividem. O nmero de clulas viveis diminui
Morte negativa A taxa de morte acelerada; o nmero de
clulas diminui de modo exponencial.
Tipicamente todas as clulas morrem em dias ou
meses
6- Mtodos de Medida do Crescimento Microbiano
Contagem de Clulas Totais
As clulas presentes em um determinado volume de cultura podem ser contadas
diretamente ao microscpio,onde o nmero obtido ser o nmero total de clulas
presentes na cultura por unidade de volume

Contagem de Clulas Viveis
Pode ser determinado pela semeadura de diluies adequadas da cultura, onde
cada microrganismo vivel dar origem a uma colnia. O nmero de clulas
viveis geralmente expresso em unidades formadoras de colnias (UFC).

Determinao da Massa Celular
feito atravs de medio da turbidez em uma suspenso microbiana. A turbidez,
quantidade de luz absorvida e dispersa pela suspenso, proporcional massa
celular e d uma estimativa indireta do nmero total de indivduos presentes na
populao. Estas medidas podem ser feitas em um espectrofotmetro.
A quantidade de luz que atravessa o detector inversamente proporcional ao
n. de bactrias.
Quanto > o n. de bactrias < a quantidade de luz que transmitida
Figura - Determinao do n de bactrias por turbidimetria.