Primeira Oficina de Trabalho das Redes Nacionais de Laboratrios
Dra. Maria Ins de Moura Campos Pardini
Pesquisadora do Depto. de Clnica Mdica da FMB Responsvel pelo Lab. de Biologia Molecular do Hemocentro-Botucatu Dogma Central da Biologia Molecular DNA RNA Protena RECEPTORES DE CITOCINAS Duas cadeia antiparalelas, dispostas em dupla hlice. FOSFATO - O P O CH 2
O O -
C1 C2 C3 C4 O OH H N N O NH 2
ACAR BASE NITROGENADA NUCLEOTDEO Adenina (A) Timina (T) Guanina (G) Citosina (C) A - T C - G Bases Nitrogenadas -
-
C1
C2
C3
C4
O OH H -
-
C1
C2
C3
C4
O OH H -
-
C1
C2
C3
C4
O OH H DNA genmico Taq polimerase Primers Tampo
dCTP dATP dGTP dTTP
94C 5 min 72C 30 s 57C 30 s PREPARO DAS AMOSTRAS TRANSCRIO REVERSA PCR PROPRIAMENTE DITO (mimetiza a duplicao) DETECO
(Expresso do gene) TATA box: -25 a -30 bp acima do incio do stio de transcrio.
TFIID: fator de transcrio geral que liga-se ao TATA box. Contm 2 tipos de sub-unidades TATA binding protein (TBP): liga-se ao TATA box e a TAFs. TBP-associated factors (TAFs): 10-12 protenas que ligam-se ao TBP.
TFIIB: liga o complexo TFIID RNA polymerase.
TFIIF: liga a RNA polymerase ao TFIID.
TFIIE and TFIIH: liga-se ao complexo enzimtico e inicia a transcrio.
Seqncia iniciadora (Inr): est presente em alguns genes e ajuda no alinhamento do complexo. A Inr liga-se aos TAFs. Domnios dos fatores de transcrio Domnio de ligao ao DNA: ancora o FT ao stio correto no promotor ou no enhancer.
Domnio de ativao: estimula a transcrio por interao com outros FTs como os TAFs.
Os hormnios esterides difundem-se pela membrana e ligam- se a receptores citoplasmticos que estimula a transcrio de genes alvo A ligao do hormnio ao receptor promove a interao desse receptor a uma protena G. A sub- unidade alfa da protena G estimula a adenil ciclase, que cataliza ATP AMP cclico O cAMP liga-se protena quinase A que, no ncleo, fosforila o fator de transcrio CREB (CRE-binding protein). CRE = elemento respondedor de cAMP TRANSCRIO TRANSCRIO RNA cDNA DNA cDNA TR RNASE H TR TRANSCRIO REVERSA LIBERAO DO CIDO NUCLEICO ISOLAMENTO AMPLIFICAO (mimetiza a transcrio) DETECO NASBA NUCLEIC ACID SEQUENCE BASED AMPLIFICATION DETECO DO CIDO NUCLEICO LIBERAO DO CIDO NUCLEICO ISOLAMENTO DO CIDO NUCLEICO AMPLIFICAO DO CIDO NUCLEICO LIBERAO DO CIDO NUCLEICO 1 ML DE PLASMA TAMPO DE LISE ISOLAMENTO DO CIDO NUCLEICO SLICA CALIBRADORES Qa, Qb, Qc ISOLAMENTO DO CIDO NUCLEICO ELUIO DO RNA LAVAGENS PRIMER RNA ELUDO AMPLIFICAO DO CIDO NUCLEICO ENZIMAS 41 0 C 41 0 C I S O T
R M I C 0 ELETROQUIMIOLUMINESCNCIA LUZ EMITIDA PELAS SONDAS QUANTIDADE DE AMOSTRA AMPLIFICADA LEITURA LEITURA PREPARAO DAS AMOSTRAS HIBRIDIZAO DAS SONDAS E DAS MOLCULAS AMPLIFICADORAS DO SINAL DETECO Ministrio da Sade, 1998
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