CAPITULO 4

ENZIMAS
BIOQUMICA APLICADA
ENZIMAS
Sustancias proteicas elaboradas por una
clula viva que catalizan una reaccin
especfica necesaria para el mantenimiento
de la vida.
Algunas Aplicaciones de las Enzimas
Algunas aplicaciones de las enzimas
Enzimas Aplicaciones
Amidasas Produccin de aminocidos
Amilasas Detergencia. Hidrlisis de almidn
Amiloglucosidasa Hidrlisis de almidn
Catalasa Produccin de cido glucnico.
Celulasas
Aplicaciones analticas
Detergencia. Hidrlisis de celulosa
Glucanasas Hidrlisis de almidn
Glucosa isomerasa Produccin de jarabes de fructosa
Glucosa oxidasa Produccin de cido glucnico.
Hemicelulasas
Aplicaciones analticas
Hidrlisis de hemicelulosa
Invertasa Hidrlisis de sacarosa
Lacasas Blanqueo de pasta de papel
Lipasas Detergencia. Biotransformaciones
Pectinasas Clarificacin de zumos de frutas
Penicilina acilasa Produccin de antibiticos semi-sintticos
Proteasas Detergencia. Biotransformaciones
REACCIN CATALIZADA POR UNA ENZIMA.
CARACTERISTICAS DE ENZIMAS
Estructura globular
Alto poder catalitico
Accion a condiciones ambientales
Especificidad
a.- Estructura globular
b.- Alto poder catalitico
Catalizadores inorganicos. 10
2
-10
3
veces
Enzimas. 10
6
-10
20
Ejplo.catalaza (hidratacion del CO
2
) CO
3
NH
2
.
10
7
veces
c.- Accin a condiciones ambientales
Produccin de NH3






Fijacion biolgica de nitrgeno.



d.- Especificidad.
Solo catalizan reacciones especficas.
Ejplo. Accin de enzimas amilasas.
SITIO ACTIVO O CENTRO CATALTICO

- Las enzimas poseen uno o
ms sitios especficos donde se
une el o los sustratos de una
reaccin.
- En l se encuentran los
residuos catalticos que
participan en la reaccin
enzimtica.
Centro activo
interaccionan a travs de enlaces entre los grupos R
de los aminocidos del centro activo y determinados
grupos funcionales del ligando.
Accin del sitio activo
El substrato se une a una regin especfica de la enzima,
denominada el sitio activo, en cada ciclo cataltico, y la catlisis
ocurre slo en dicho sitio.
Accin de fuerzas de atraccin dbiles (efectos inicos, puentes
de hidrgeno, atracciones hidrofbicas entre grupos no polares),
aunque se conocen casos en los que interviene un enlace
covalente.

Aminocidos comunes ubicados en sitios activos de
enzimas

Modelos de interaccion
d.- Especificidad.
Aunque algunas enzimas son poco
especficas, la mayora catalizan una sola
reaccin para unos ciertos substratos.
La mayora de los catalizadores utilizados en
la industria qumica son no especficos, es
decir, catalizan reacciones similares
involucrando diferentes tipos de reactivos.







FACTORES QUE AFECTAN LA ACCION
ENZIMATICA
Temperatura.
pH.
Concentracin del sustrato
Presencia de cofactores
Efecto del pH sobre la actividad enzimtica
Los aminocidos que constituyen las protenas contienen grupos ionizables que
puede estar cargados positiva o negativamente a un pH determinado.
Estos grupos ionizables pueden formar parte del centro activo, de manera que
slo sea activa una forma ionizada de la enzima.
De esta forma, en funcin del pH, la enzima activa catalticamente ser una
fraccin mayor o menor de la enzima total presente.
La representacin usual del efecto del pH se ilustra con el siguiente modelo
sencillo para la ionizacin del sitio activo:
En el esquema anterior, E- representa la forma activa, mientras E y E2- son
formas inactivas obtenidas por protonacin y desprotonacin del sitio activo.
En consecuencia, en la mayora de los casos, la actividad enzimtica pasa
por un mximo (pH ptimo).
Efecto del pH
b.- Efecto de la temperatura
En cintica qumica, el efecto de la temperatura sobre la
constante de velocidad de reaccin se describe, usualmente,
mediante la ecuacin de Arrhenius:
Donde k es la constante de velocidad de reaccin, E
A
la energa
de activacin y A el factor pre-exponencial.
En el caso de la catlisis enzimtica, hay que tener en cuenta que
las enzimas slo son activas en un rango limitado de
temperaturas.
A temperaturas elevadas se producen modificaciones de su
estructura terciaria, conduciendo a la desnaturalizacin del
biocatalizador.
Efecto de T
Coeficiente Q
Se mide dentro del rango de incremento de la
actividad enzimatica.
Q
10
=velocidad de reaccion a T = (T+10).
velocidad de reaccion a T = T1

d.- Presencia de cofactores
Algunas enzimas actan con la ayuda de
estructuras no proticas.
En funcin de su naturaleza se denominan:
1. Cofactor. Cuando se trata de iones o molculas
inorgnicas.
2. Coenzima. Cuando es una molcula orgnica.
- muchas vitaminas funcionan como coenzimas.
2. CLASIFICACIN DE LAS ENZIMAS
Formas tradicionales de designar :
A) Aadiendo el sufijo -asa al sustrato ( amilasas)
B). El de la reaccin que catalizan (alcohol deshidrogenasa,
cataliza la deshidrogenacin de un alcohol).
C) Segn su origen. Papaina.
D). Nombres propios. Pepsina.
Es poco prctica, no sistemtica y poco informativa desde el
punto de vista qumico.
La Enzyme Commission ha adoptado una clasificacin
basada en la naturaleza de la reaccin catalizada .
Divide a las enzimas en seis grupos principales, cada uno de
ellos en clases, y stas en sub
Grupos de enzimas
1. xido-reductasas
(Reacciones de oxido-
reduccin).

Si una molcula se reduce, tiene que
haber otra que se oxide

2. Transferasas
(Transferencia de grupos
funcionales)

grupos aldehdos
grupos acilos
grupos glucsidos
grupos fosfatos (kinasas)

Clase 1: Oxidorreductasas
Catalizan reacciones de oxidorreduccin,
transferencia de (H+) o (e
-
) de un sustrato a otro:
AH
2
+ B A + BH
2

A
red
+ B
ox
A
ox
+ B
red


Ejemplos son la succinato deshidrogenasa o la
citocromo c oxidasa.
Clase 2: Transferasas
Catalizan la transferencia de grupo qumico (distinto
del hidrgeno) , segn la reaccin:
A-B + C A + C-B
Ejemplo. glucoquinasa, cataliza la reaccin:
glucosa + ATP ADP + glucosa-6-fosfato
3. Hidrolasas
(Reacciones de hidrlisis)


Transforman polmeros en
monmeros.
Actan sobre:
enlace Ester
enlace glucosdico
enlace peptdico
enlace C-N

4. Liasas
(Adicin a los dobles
enlaces)


Entre C y C
Entre C y O
Entre C y N

5. Isomerasas
(Reacciones de isomerizacin)

6. Ligasas
(Formacin de enlaces, con aporte de ATP)

Entre C y O
Entre C y S
Entre C y N
Entre C y C

Clases E. C. para las enzimas
1. XIDORREDUCTASAS
(Reacciones de oxidacin-reduccin)
1. Actan sobre CH-OH
2. Actan sobre C=O
3. Actan sobre CH=CH
4. Actan sobre CH-NH2
5. Actan sobre CH-NH
6. Actan sobre NADH o NADPH
7. Actan sobre otros compuestos nitrogenados
8. Actan sobre un grupo sulfuro
9. Actan sobre un grupo hemo
10. Actan sobre difenoles
11. Actan sobre perxido de hidrgeno
12. Actan sobre hidrgeno
13. Actan sobre donadores sencillos con incorporacin de 0, (oxigenasas)
14. Actan sobre donadores complejos con incorporacin de 02
15. Actan sobre radicales superxido
16. Oxidan iones metlicos
17. Actan sobre CH2
18. Actan sobre ferredoxina reducida
19. Actan sobre flavodoxina reducida Otras xidorreductasas

2. TRANSFERASAS
(Transferencia de grupos
funcionales)
1. Grupos con un carbono
2. Grupos aldehdo o cetona
3. Grupos acilo
4. Grupos glicoxilo
5. Grupos alquilo o arilo
6. Grupos nitrogenados
7. Grupos que contienen
fsforo
8. Grupos que contienen
azufre
3. HIDROLASAS
(Reacciones de hidrlisis)
1. steres
2. Enlaces glucosdicos
3. Enlaces ter
4. Enlaces peptdicos
5. Otros enlaces C-N
(diferentes del peptdico)
6. Anhdridos de cido
7. Enlaces C-C
8. Enlaces haluro
9. Enlaces P-N
10. Enlaces S-N
11. Enlaces C-P
4. LIASAS
(Adicin a dobles enlaces)
1. Liasas C-C
2. Liasas C-O
3. Liasas C-N
4. Liasas C-S
5. Liasas C-haluro
6. Liasas P-O

5. ISOMERASAS
1. Racemosas y epimerasas
2. Isomerasas cis-trans
3. Oxidorreductasas
intramoleculares
4. Transferasas intramoleculares
5. Liasas intramoleculares
6. LIGASAS
(Formacin de enlaces acoplados
con la transformacin de
substancias como ATP o
nuclesidos)
Enlaces C-O
Enlaces C-S
Enlaces C-N
Enlaces C-C
Enlaces ster fosfrico
Nomenclatura sistemtica
Codigo EC.
Utiliza el prefijo EC delante del nmero.
Se usa un codigo. EC.v.x.y.z.

Basada en la naturaleza de la reaccin catalizada
Nombre del o los sustratos, tipo de reaccin.
Algunos de los nombres sistemticos son muy
largos, en la prctica se siguen utilizando los
nombres triviales.

Actividad enzimtica
los extractos enzimaticos contienen protena no cataltica, siendo difcil
conocer exactamente la masa de biocatalizador.
Por eso, la concentracin de enzima se expresa habitualmente en trminos
de unidades de actividad en lugar de concentracin molar o msica.
UI. Es la cantidad de enzima o extracto enzimatico contenida en 1 ml de
solucin, capaz de transformar 1 umol de sustrato o producto en 1 min en las
condiciones optimas.
La actividad especfica :
= unidades de actividad/mg de protena = mol de producto/(mg de
protena) (ml min)
Ejplo. En proteasa papana (EC 3.4.22.2), se define una unidad de actividad
como la cantidad de enzima que hidroliza 1 mol de BAEE (ster etlico de
N(x-benzoil-L-arginina) por minuto a pH 6,2 y 25C. Las preparaciones
comerciales de esta enzima, obtenida de fuente vegetal, contienen de 10-40
unidades/mg protena.
1 Katal. Actividad de un extracto capaz de transformar 1 mol de sustrato por
segundo
catlisis enzimtica.
La catlisis enzimtica implica la formacin de un complejo entre el
reactivo (substrato) y la enzima, en un proceso de equilibrio. Este complejo
(ES) se denomina usualmente complejo de Michaelis. La formacin del
producto se produce segn el siguiente esquema de reacciones:
La existencia del complejo enzima-substrato ha sido verificada por
diferentes tcnicas tales como cristalografa de rayos X,
espectroscopa y resonancia de spin electrnico.
CINETICA ENZIMATICA
Cintica de reacciones con un slo substrato
Ecuacin de Michaelis-Menten
Michaelis y Menten propusieron un modelo para relacionar la
velocidad de reaccin con la concentracin de substrato.
Suponiendo la existencia de un solo complejo central, el
esquema de reaccion sera:




Velocidad de reaccin vs. Concentracin de
substrato
Efecto saturante
Significado de Km
(A)
(B)
(C)
E+ S
ES
E P
Determinacin de los parmetros cinticos de la ecuacin de
Michaelis-Menten
La Linearizacin de Lineweaver-Burk .
es un artificio matemtico que permite deducir
grficamente los valores de km y Vm para
reemplazarlos en la ecuacin M-M.
El artificio consiste en convertir a la ecuacin M-M en
la ecuacin de una recta.
1/v = ([S] + km)/Vm[S]
1/v = 1/Vm + km/Vm[S]
Que es la ecuacin de una recta de la forma Y = A + BX,
donde:
Y = 1/v, A = 1/Vm, B = km/Vm, y X = 1/[S]
Funcion linearizada
Ploteo de Eadie-Hostee
En este caso el ploteo se realiza entre vi versus vi[S], con ese fin
se multiplica ambos miembros de la inversa de la ecuacin M-M
por el factor vi.Vmax obtenindose:
Vmax (vi) = KmVmax(vi) + Vmax(vi)[S]
vi Vmax[S] Vmax [S]
Vmax = Km.vi + vi
[S]
Ordenando:
vi = Vmax - Km.vi
[S]

Esta es una ecuacin de lnea recta de la forma Y = a - bX, en ella
la pendientes es igual a Km y el valor de la ordenada en el
origen corresponde a Vmax.

vi = Vmax - Km.vi
[S]

Ploteo de Hanes- Wolf
[S] = Km. + [S] . 1 .
Vi Vmax Vmax
[S]
V
[S]
1
V

m
a
x
Km
V max
0

Ploteo Eisentahl-Cornish
Vmax = vi + vi.Km
[S]
V max
[S]
Km
V
EFECTORES ENZIMATICOS
Activadores
inhibidores
No competitiva
V = Vmax. S . .1.
Kmax+S (1+I/Ki)
Incompetitiva
Incompetitiva
V = Vmax. S/(1+I/Ki)
S + Km(1+I/Ki)
Inhibidores
Se denominan inhibidores aquellas substancias que provocan
que una reaccin enzimtica transcurra ms lentamente.
Este efecto puede producirse de diversas maneras:
a) Mediante un anlogo del substrato que se une (reversible o
irreversiblemente) al centro activo, reduciendo la actividad
enzimtica,
b) Mediante la unin de un inhibidor a otra parte de la
molcula enzimtica provocando cambios conformacionales
que reducen la capacidad de la enzima para unirse al
substrato.
Distinguiendo de la reversibilidad pueden ser:
a) Inhibicin irreversible. El inhibidor se combina con la enzima
dando un complejo estable, pero inactivo.
b) Inhibicin reversible.

Antibiticos
Insecticidas
Hervicidas
Venenos
Diferentes Medicamentos
Inhibicin enzimtica
Dolor
Inflamacin
Infecciones
virales
Cncer
Inhibidor Irreversible
Fluorofosfato de diisopropilo (DFP)
Acetilcolina
Acetilcolinesterasa
Acetato + Colina
Acetilcolinesterasa
Tripsina
Elastasa
Fosfoglucomutasa
Cocoonasa (larvas de
gusanos de seda

Malatin
Inhibidor Irreversible
Fluorofosfato de diisopropilo (DFP)
Inhibidor Reversible
La unin del inhibidor y la enzima es reversible.
Al quitar el inhibidor del medio, se recupera la
actividad.

Hay 3 tipos:
Competitiva
No Competitiva
Acompetitiva (Alostrica)
Inhibicin Competitiva
Inhibicion competitiva
Competitiva.
V = VmaxS
S + Km( 1 + I/Ki)
Malonato Deshidrogenasa del cido succnico
Sulfas Infecciones microbianas
Antihipertensores: Captopril y Enalopril
Alopurinol Controla la gota
Fluoruracilo Cncer
Inhibidores Competitivos
Inhibicin No Competitiva
Inhibicin no competitiva en un grfico de dobles recprocos
K
m
se mantiene
V
max
disminuye
Inhibicin acompetitiva
El inhibidor se une a un sitio diferente al sitio
activo afectando la catlisis. La K
m
se mantiene
y la V
max
disminuye.
Inhibicin acompetitiva
Reacciones enzimticas con ms de un substrato
Reacciones entre dos o ms substratos para conducir a dos o ms
productos.
Un caso, son Rx catalizadas por enzimas que utilizan cofactores
(por ejemplo NAD+ en las xidorreductasas), donde el cofactor
hace el papel de segundo substrato.
Mecanismos para explicar este tipo de reacciones, la mayora
pueden clasificarse en dos tipos:
a) Todos los substratos se unen a la enzima antes de la catlisis
(en caso de dos substratos se denomina mecanismo de
formacin de complejo ternario);
b) Se libera un producto a partir de un primer complejo binario
antes de la unin con el segundo substrato.
a.- Reacciones mediante formacin de un complejo ternario.
En este caso, el complejo ternario puede formarse independientemente
del orden de unin de los substratos (aleatorio), o bien nicamente en
un orden determinado (mecanismo ordenado).
Mecanismo aleatorio. Los substratos A y B forman un complejo con la
enzima. Cualquiera de ambos puede combinarse con el otro substrato
para formar el complejo ternario EAB, que conduce a los productos X e
Y y a regenerar la enzima:
Mecanismo ordenado. Un substrato (A) se une inicialmente con la
enzima formando el complejo EA. El segundo substrato slo se une
al complejo EA para conducir al complejo ternario EAB:
b.- Reacciones enzimticas sin formacin de un complejo ternario.
El mecanismo se denomina ping-pong, formndose un complejo de la
enzima con un substrato (EA), que libera el producto X, quedando como
EA' (por ejemplo, un acil-enzima) que es atacado por el segundo
substrato (por ejemplo, transfirindose el grupo acilo).
APLICACIONES
Produccion de enzimas.
Extraccion de enzimas.
Aplicaciones de enzimas
Diagrama produccion de enzimas
APLICACIONES DE ENZIMAS EN INDUSTRIA ALIMENTARIA
La gran especificidad de accin que tienen los enzimas
hace que no se produzcan reacciones colaterales
imprevistas.
Asimismo se puede trabajar en condiciones moderadas,
especialmente de temperatura, lo que evita alteraciones
de los componentes ms lbiles del alimento.
Adems los enzimas pueden inactivarse fcilmente
cuando se considere que ya han realizado su misin,
quedando entonces asimilados al resto de las protenas
presentes en el alimento.
Industrias lcteas
El cuajo del estmago de los rumiantes es un producto clsico en
la elaboracin de quesos, y su empleo est ya citado en la Iliada y
en la Odisea.
Sin embargo, el cuajo se obtuvo como preparacin enzimtica
relativamente pura solo en 1879.
Est formado por la mezcla de dos enzimas digestivos (quimosina y
pepsina) y se obtiene del cuajar de las terneras jvenes.
Estos enzimas rompen la casena de la leche y producen su
coagulacin.
Desde los aos sesenta se utilizan tambin otros enzimas con una
accin semejante obtenidos a partir de microorganismos o de
vegetales
Lactasa, un enzima que rompe la lactosa, que es el azcar de la
leche. Ya se comercializa leche a la que se le ha aadido el enzima
para eliminar la lactosa.
Panadera
En panadera se utiliza lalipoxidasa, simultneamente
como blanqueante de la harina y para mejorar su
comportamiento en el amasado.
La forma en la que se aade es usualmente como
harina de soja o de otras leguminosas, que la
contienen en abundancia.
Para facilitar la accin de la levadura, se aade
amilasa, normalmente en forma de harina de malta,
aunque en algunos pases se utilizan enzimas
procedentes de mohos ya que la adicin de malta
altera algo el color del pan.
Cervecera
A principios de este siglo (1911) se patent la utilizacin de la
papana para fragmentar las protenas presentes en la cerveza y
evitar que sta se enturbie durante el almacenamiento o la
refrigeracin, y este mtodo todava se sigue utilizando.
Un enzima semejante, la bromelana, se obtiene de la pia
tropical.
Un proceso fundamental de la fabricacin de la cerveza, la rotura
del almidn para formar azcares sencillos que luego sern
fermentados por las levaduras, lo realizan las amilasas presentes en
la malta, que pueden aadirse procedentes de fuentes externas,
aunque lo usual es lo contrario, que la actividad propia de la malta
permita transformar aun ms almidn del que contiene.
Cuando esto es as, las industrias cerveceras aaden almidn de
patata o de arroz para aprovechar al mximo la actividad
enzimtica.
Fabricacin de zumos
A veces la pulpa de las frutas hace que los zumos sean
turbios y demasiado viscosos.
Esto es debido a la presencia de pectinas, que pueden
destruirse por la accin de enzimas presentes en el propio
zumo o bien por enzimas aadidas obtenidas de fuentes
externas.
Esta destruccin requiere la actuacin de varios enzimas
distintos, uno de los cuales produce metanol, que es
txico, aunque la cantidad producida no llegue a ser
preocupante para la salud.
Fabricacin de glucosa y fructosa a partir del maz
Jarabes fructosados. se utilizan en la elaboracin de bebidas
gaseosas, conservas de frutas, repostera, etc. en lugar del
azcar de caa o de remolacha.
La forma antigua de obtener estos jarabes, por hidrlisis del
almidn con un cido, ha sido desplazada por la hidrlisis
enzimtica.
la CE ha limitado severamente la produccin de estos jarabes
para evitar el hundimiento de la industria azucarera clsica.
Los enzimas utilizados son; alfa-amilasas y amiloglucosidasas.
La glucosa formada puede transformarse luego en fructosa,
otro azcar ms dulce, utilizando el enzima glucosa-isomerasa,
usualmente inmovilizado en un soporte slido.
Otras aplicaciones
En la fabricacin de productos derivados de huevos, las trazas
de glucosa presentes, que podran oscurecerlos, se eliminan
con la accin combinada de dos enzimas, la glucosa-oxidasa y
la catalasa.
Por otra parte, la papana y bromelna, enzimas que rompen las
proteinas, se pueden utilizar, fundamentalmente durante el
cocinado domstico, para ablandar la carne.
APLICACIONES EN INDUSTRIA DE DETERGENTES
La tecnologa de enzimas en los detergentes se desarroll a
partir de los aos 60.
Proteasas, las cuales degradan restos de protenas; y Lipasas que
degradan lpidos que son los que comnmente se adhieren a la
ropa y a ellas se les adhieren el resto de la suciedad como polvo,
restos de otros compuestos orgnicos etctera.
Los detergentes que contienen enzimas se les llama detergentes
biolgicos.
El problema se presenta al usar exceso de estos detergentes, con
lo cual se desechan enzimas activas al drenaje, las cuales al llegar
a los cuerpos de agua provocarn daos en los seres vivos
presentes en stos, por accin directa sobre ellos o sobre los
nutrientes que componen su dieta alimenticia.
APLICACIONES DE LA ENZIMAS EN ENERGA
Otra actividad de aplicacin de enzimas en biotecnolgica es en
la produccin biocombustibles renovables.
Cada ao crecen unas 200 mil millones de toneladas de biomasa
(madera, cereales, etc), de las cuales los humanos usamos slo un
3%. Por lo tanto, este rubro ofrece un enorme potencial que
puede ser aprovechado.
Alcohol obtenido por fermentacin de azcares, almidn, o
residuos forestales.
El principal obstculo para la viabilidad de esta propuesta es el
costo, puesto que el petrleo sigue siendo ms barato. Sin
embargo, los avances tecnolgicos estn permitiendo acortar la
brecha.
Ejemplos.
1. En una reaccion enzimatica que transcurre
con una concentracion de enzimas de 0,015g/l,
se obtienen los siguientes datos:
S(g/l) 20 15 10 7.0 5.0 4.0 3.0 2.5
v(g/l-min)1.14 1.01 0.87 0.72 0.59 0.5 0.44 0.35
Deduzca el modelo que representa la cinetica
del proceso.


Representando graficamente se
tiene:
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
0 5 10 15 20 25
Deduccion de los,coeficientes de la
ecuacion de Monod.
S v (g/l-min) 1/S 1/v
20 1.14 0.05 0.877
15 1.01 0.066 0.990
10 0.87 0.10 1.149
6.5 0.70 0.15 1.428
5.0 0.59 0.20 1.695
4.0 0.50 0.25 2.000
3.3 0.44 0.30 2.273
2.5 0.35 0.40 2.857
Graficando a Linewaber-Burk
y = 5.3879x + 0.6147
R = 0.9914
0.0000
0.5000
1.0000
1.5000
2.0000
2.5000
3.0000
0.000 0.050 0.100 0.150 0.200 0.250 0.300 0.350 0.400 0.450
1/v
Interaccion.= 1/vmax=0.614
vmax = 1.628 g/l-min.
Pendiente: Km/vmax. = 5.387
Km = 8.776 g/l
El modelo ser.
V = Vmax.S/(Km+S)
V = 1.628S/(8.776+S)
Comprobar por Eadi-Hostie
V = Vmax Km.V/S
y = -0.1148x + 0.1861
R = 0.9758
0.000
0.020
0.040
0.060
0.080
0.100
0.120
0.140
0.160
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2
v/S