蛋白质互作

及其功能
一 . 蛋白质互作研究的意义
二 . 蛋白互作研究的基本方法
三 . 蛋白质互作研究事例
一 . 蛋白质互作研究的意
义 基因表达调控

生命活动 细胞活动 : 基因是关键

蛋白质 : 修饰
单个蛋白 : 较少

蛋白作用 蛋白复合体 动态

与其它分子结合 : 信号转导

蛋白质相互作用 : 结构 , 最具挑战
性
蛋白互作是动态的 Science, 2008, 320:1429-1430

induced fit and conformation selection mechanisms:

prior to the binding interaction, the unliganded protein
exists as an ensemble of conformations in dynamic
equilibrium.

three steps: a diffusional encounter, recognition of

complementary structures contained within the
conformational ensembles of the free proteins, and
conformational relaxation into the final bound state
二 . 蛋白互作研究的基本方法
互作蛋白的筛选
蛋白互作的证实
基本方法：

1. GST pull down (pull down)

2. 免疫共沉淀（ CoIP ）
3. 酵母双杂交（细菌双杂交）
4. 噬菌体展示
5. 蛋白质芯片
6. 化学交联
7. 荧光共振能量转移（ FRET ）
8. 等离子表面共振技术
9. 遗传途径
10. 串联亲和纯化技术
11. 利用原子力显微检测配体与受体互作
12. Native/SDS-PAGE
1. GST (Glutathione-S-transferase ) pull-down assay

Sepharose SDS-PAGE
GSH
GST “X” “Y” Western blot

|BamH1 | |EcoR1 ||SmaI |SalI | XhoI | NotI |

... ATC GAA GGT CGT GGG ATC CCC AGG AAT TCC CGG GTC GAC TCG AGC GGC
CGC ...
... TAG CTT CCA GCA CCC TAG GGG TCC TTA AGG GCC CAG CTG AGC TCG CCG
GCG ...
... Ile Glu Gly Arg Gly Ile Pro Arg Asn Ser Arg Val Asp Ser Ser Gly
Arg ...
| Factor Xa |

His tag

Pull down: GST, His

2. 免疫共沉淀
Co-Immunoprecipitation
(CoIP)

Protein A
或
Protein G

不受互作蛋白结合位点影响
蛋白条带较多

是筛选互作蛋白最有效的方法
3. 酵母（细菌）双杂交

Yeast 2-Hybrid Assay

his- leu- trp-

DBD bait
trp
AD fish
leu

细菌双杂交
AD

reporter
D

Measurable
DB

his
product
nucleus
4. 噬菌体展示

基本原理：
将编码“诱饵”蛋白的 DNA 片段插
入噬菌体基因组，并使之与
噬菌体外壳蛋白编码基因相
融合。重组噬菌体侵 染宿主
细菌后，复制形成大量带有杂
合外壳蛋白的噬菌体颗粒，直
接用于捕获靶蛋白库中与 “诱
饵”相互作用的蛋白质。
5. 蛋白质芯片
6. 化学交联

化学交联法（ chemical cross-linking ）：

蛋白亲核侧链和多肽链末端的氨基酸可与化学交联剂发生交
联
反应
互作蛋白彼此结合或靠近，选择合适的交联剂，通过化学交
联
反应得到蛋白交联复合物，再利用蛋白质电泳或放射自显影
等
技术，鉴定有互作的蛋白。
化学交联法可检测到很微弱的互作及难溶的蛋白质之间的互作
化学交联法适于研究能够形成稳定复合物的蛋白质间的相互作用

甲醛为常用交联剂
 7. 荧光共振能量转移技术（ FRET ）

两个荧光发色基团在足够近（ <100A ）时，可发生能量转移。

荧光能量转移有 3 个基本条件：
给体与受体在合适的距离（ 1 ～ 10 nm ）
给体的发射光谱与受体的吸收光谱有 一定的重叠（这是能量匹配的条件）
给体与受体的偶极具有一定的空间取 向（这是偶极 - 偶极耦合作用的条件）

FRET 应用：
研究分子内部对某些刺激发生的构象变化
研究分子间的相互作用
8. 等离子表面共振技术（ Surface plasmon
resonance ）

该技术将诱饵蛋白结合于葡聚糖表面，葡聚糖层固定于几十纳米厚的金属膜表面，
当有蛋白质混合物经过时，如果有蛋白质同“诱饵”蛋白发生相互作用，那么两者的
结合将使金属膜表面的折射率上升，从而导致共振角度的改变，而共振角度的改变
与该处的蛋白质浓度成线性关系，由此可以检测蛋白质之间的相互作用。

该技术不需要标记物和染料，安全灵敏快速，还可定量分析。
缺点：需要专门的等离子表面共振检测仪器。
9. 遗传学方法

使某处发生缺损，检测对其他地方的影响。
● 基因外抑制子：通过一个基因的突变来弥补原有基因的突变。
比如互作蛋白 A 和 B ，如果 A 发生了突变使两者不再互作，此
时 B如
果再发生弥补性突变就可以使两者的互作恢复，那么 B 就是
A
的基因外抑制子。
缺点：需要知道基因，要有表型，筛选抑制子比较费时。
● 合成致死筛选：两个基因同时发生突变会产生致死效应，而当
每个基因单独发生突变时则无致死效应。用于分析两个具有相同
重要蛋白之间的相互作用。
10. 串联亲和纯化技术（ TAP ）

该技术综合了融合蛋白亲和色谱法及免疫共沉淀技术的优势，通过两
步
特异性的亲和纯化获得与目标蛋白结合的蛋白质复合物。

首先在目标蛋白的一端依次导入钙调蛋白结合肽、 TEV 蛋白酶切位点

和
蛋白标签（如蛋白 A 的 IgG 结合区、寡聚组氨酸肽段等），进而在宿
主
细胞中进行融合表达，在生理条件下形成与目标蛋白相互作用的蛋白
复合物。在蛋白复合物的分离纯化中，第一步利用与蛋白标签具有亲
和作用的色谱柱，采用 TEV 蛋白酶断裂 TEV 蛋白酶切位点的方式洗
脱；
第二步利用与钙调蛋白结合肽具有亲和作用的钙调蛋白色谱柱，将蛋
白复合物和 TEV 蛋白酶分开，纯化出的蛋白复合物进一步用凝胶电泳
、
质谱技术或 Edman 降解法进行鉴定。
目的蛋白与标签蛋白（ Flag ， HA 等）融合 , 在细胞内
表达

细胞提取物 , Flag 或 HA 等的抗体免疫沉淀

复合体分析：质谱等
11. 原子作用力显微技术（ AFM ）

在扫瞄隧道显微技术的基础上发展起来的， AFM 通过力扫描方式，

以
单分子水平的高分辨率测量蛋白质间的相互作用力，如在配体 - 受体
间相互作用力的研究中，配体被固定于 AFM 的弹性悬臂表面，受体
被
固定于适当的基底表面，在悬臂接近和离开基底的过程中，通过悬
臂
的偏折便可测得配体受体间的作用力。
12. Native/SDS-PAGE
Min 45 90 135 180 Min 40 90 135 180

Native-120min Native-160min
三 . 蛋白质互作研究事例
1) 概述
病毒 - 对虾蛋白互作
White spot syndrome virus
(WSSV)

对虾 : 无脊椎动物，仅有先天性免疫系统 , 无特异性免疫
。
体表阻挡
无脊椎动物
免疫系统 细胞系统：吞噬细胞、细胞凋亡
体液防御系统：干扰素、抗病毒肽、凝集素等
 非特异性免疫

（ 1 ）模式识别：模式识别因子
（ 2 ）信号转导：受体藕联蛋白
信号转导
（ 3 ）抗病毒效应：干扰素 , 抗病
毒肽 , 细胞凋亡 , 细胞吞噬。

蛋白质互作
特异性免疫

Nature 2005, 434:

27

蛋白质互作 如何开始研究 ?
2) 对虾抗病毒相关功能基因筛选

抗病对虾： mRNA 差异显示技术（ DD-PCR ），抑制差减杂交，亲和层析

70 个对虾抗病相关基因，其中 30 个新基因

7 9

3
6
4 8
2
Rab: 抗病毒对虾中上调表达
说明在抗病毒免疫反应中起作用
重要的小 G 蛋白
 小 G 蛋白 : GTPase, 20-25
kDa 5 个家族
Ras: 细胞生长调节
Rho: actin 细胞骨架重组 , 基因表达调控
Rab: 膜性颗粒的锚定与融合
Arf: 调节膜性颗粒的运输
Ran: 调控核内运输

Rab 蛋白在体内以两种构象形式存在，活化的 Rab 蛋白为 GTP 结合形

式，位于
胞膜；未活化的 Rab 蛋白与 GDP 结合，位于胞浆。
Cell, 2007, 129: 865
Rab 蛋白 : 所有的真核生物中都有 Rab 蛋白
酵母中的 Rab 蛋白称为 Ypt 蛋白 ,7 个 Rab 蛋白
线虫 (C elegans) 29 种 Rab 蛋白
果蝇 (Drosophila melanogaster)26 种 Rab 蛋
白
拟南芥 (Arabidopsis thaliana)57 种 Rab 蛋白

人有 60 多种 Rab 蛋白

PM1-3 ， G1-3: 与 GTP 结

合/
分解相关的保守区 ,
G 结构域
F1-5: Rab 的保守区
高度可变的 N 端和 C 端
G 结构域 : 6 个 β 折叠 (β1-β6), 5 个 α 螺旋
(α1-α5) 和 5 个多肽环。
多肽环 : β 折叠与 α 螺旋之间由多肽环连接
氨基酸序列高度保守
Mg2+ 和鸟嘌呤的结合位点，同时催化
GTP 水解
开关 I 和开关 II: Rab 蛋白与它的 GEF 和
GAP 的关
键位点
 互作蛋白筛选
Rab 在抗病毒对虾中上调表达
参与抗病毒免疫反应

参与免疫的途径 ?

蛋白互作

筛选与 Rab 结合的蛋白质

GST pull-down,CoIP, 酵母 ( 细菌 ) 双杂交 , 噬菌体展示 , 蛋

白质芯片 ,
Native/SDS-PAGE
蛋白质鉴定

蛋白互作验证
功能
4) 互作蛋白的鉴定
N 端测序 :Edman sequncing
需要大量纯化的蛋白质
N －末端封闭

质谱 (masspectrometry, MS)
分析
常用 , 基因组序列
MALDI-TOF MS: matrix-
assisted
生物样品离子化方法 laser-desorption/ionization
time-of-flight
ESI-MS/MS: nano-electrospray
ionization tandem MS
(Q-TOF)

MALDI-Q-TOF, TOF/TOF
5) 蛋白互作的验证

体外 : Western blot
体内 : 细胞试验

酵母 ( 细菌 ) 双杂交
6) 功能

RNAi 抑制 Rab 基因的表达对血细胞吞噬功能的影

响
 Rab 基因过量表达对血细胞吞噬功能的影响

Rab 基因沉默对病毒感染的影
响
互作片段
900-1020 bp
VP466

tr
o
po

b
m

Ra
yo
s in
actin
 体
信号通路
900-1020 bp 外
VP466

tr
o
po
体

b
m

Ra
yo
s in
内
actin

VP466 RNAi 吞噬

TPM RNAi
细胞吞噬： actin
G-actin

F-actin
 细胞吞噬 体
900-1020 bp 外
Rab
VP466

tr
o
po
体

b
m

Ra
yo
s in
内
actin

小分子 siRNA

吞噬

overexpression
RNAi

VP466 RNAi TPM RNAi Journal of Proteome Research 2008 7: 424-431

细胞吞噬
Ran
P VP466
N

tr
op
om

b
Ra
Ranmyosin

yo
RNAi

s in
actin
小分子 siRNA
细胞吞噬

overexpression

小 G 蛋白（ Rab ， Ran ）与骨

架
蛋白直接作用调控吞
噬
病毒双功能蛋白
Zhiping Wang et al. 2008. Cell 135: 535-
548
 吞噬具有特异性

WSSV 感染 S2
第5天

无 WSSV 感染的细胞 病毒在膜状结构内

谢谢 !