PURIFICACIN DE ENZIMAS

ELECCIN DEL ORGANISMO A

PARTIR DEL CUL PURIFICAR
LA ENZIMA QUE NECESITA
Se debe tener en cuenta:
las condiciones (pH y temperatura) en las
cuales trabajar la enzima una vez
purificada.
Si hay abundancia de enzima en el
organismo o tejido con el cual se
trabajar.

Cmo eligira usted esta fuente
de enzima?
Presencia de actividad enzimtica
Cmo se determina la actividad
enzimtica?
Presencia de actividad enzimtica
La enzima es exportada
de la clula (hongos, bac-
Terias y levaduras)
Determinacin
cuantitativa

Determinacin
cualitativa
centrifugacin
Presencia de actividad enzimtica
La enzima se encuentra en
el interior de la clula

Liberar la enzima rompiendo
pared y membrana


Determinacin cuantitativa
centrifugacin
Identificacin de las Protenas
(Cuantificacin)

Cunta protena tengo?

Mtodos
Espectrofotomtricos
Electroforesis
1-D y 2-D
Absorbancia
de luz UV
Colorimetra
Biuret Lowry Bradford Fluorescamina
deteccin Electroblot
Azul de Coomassie Plata
deteccin
Amido black Fierro Oro
Anticuerpos
(western blot)
La identificacin se realiza
empleando la espectrofotometra
Porcentaje de transmitancia.
Es la razn entre la intensidad de
la luz luego de atravesar la
sustancia y la intensidad de la luz
antes de atravesar la sustancia
multiplicado por 100.
T = i/I x 100
Absorbancia..
Es el logaritmo de la transmitancia
Ley de Lambert-Beer
A=ebc
Donde:
- A es la absorbancia
- b es la longitud del paso de luz (1 cm)
- c es la concentracin de la sustancia
e es el coeficiente de extincin
Mtodos espectrofotomtricos
para detectar protenas
Absorbancia de luz ultavioleta (280nm)
Mide aminocidos aromticos
VENTAJAS:
- Rpido y directo
- La muestra no se pierde
Desventajas:
- Slo sirve para cuantificar si
se conoce el coeficiente de
extincin de la protena
Reacciones colorimtricas:
Un reactivo se une a la
protena o a los aminocidos
de la protena resultando un
producto coloreado.
Biuret
El cobre en el
reactivo de
Biuret se une
estequiometri
camente
dando un
color violeta
(mg de protena)
Unin del cobre del
reactivo de Biuret a
los grupos amino
que forman parte
del enlace peptdico
en las protenas
Bradford
(mg de protena)
El colorante azul de coomasie G
reacciona con los aminocidos
bsicos y aromticos de la
protena.
Otros mtodos que detectan mg de
protena :
-Lowry (El reactivo de Folin Ciocalteau
reacciona con los residuos de tirosina
de las protenas y el reactivo de cobre
alcalino de la misma manera que en
Biuret

-cido Bicinchnico
Ninhidrina
(ng de protena)
Fluorescamina
(pg de protena)
Cuantificacin de la protena
presente en una muestra
Ley de Lambert-Beer
A=
e bc
Absorbancia
545 nm
Albmina
mg/ml
0.1 0.5
0.2
1.0
0.3 1.5
0.4 2.5
0.5 5.0
0.6 10.0
0.7 25.0
Curva estndar de albmina
Cuantificacin de Concentracin
de protenas con actividad
enzimtica
Relacionando cantidad de protena
con la actividad enzimtica
Una unidad de actividad enzimtica
(Internacional)
es la cantidad de protena que
convierte un micromol de sustrato
a producto por minuto a 25C y a
pH ptimo.
Ureasa: una unidad (UI) liberar 1.0 mmol de
amoniaco de la rea por minuto a pH 7 y a
25C. (equivalente a 1.0 UI)
Una unidad de actividad especfica
Es el nmero de micromoles de
sustrato convertidos por minuto
por miligramo de protena.
Esto es, Unidades de actividad enzimtica
por miligramo de protena.
Una unidad de actividad molecular
Es el nmero de unidades
de actividad enzimtica por
micromol de enzima.
Cuando la enzima es citoslica,
se rompe la clula para tenerla
libre mediante homogenizacin
Tipos de homogenizacin
Sonicacin
Bajas temperaturas y presin o trituracin
Congelacin y descongelacin
Homogenizadores de vidrio manuales o
acoplados a un motor
Detergentes (enzimas asociadas a
membranas)
Sonicador
Mortero
Homogenizador de vidrio
Potter- Elvejem Dounce
Mezclador
Waring blendor
Agitador
batidor
Para separar las membranas y paredes
celulares rotas, ncleos y partculas
subcelulares del citosol se realiza una
centrifugacin.
Luego de centrifugar, se recoge el
sobrenadante que es un preparado
crudo de enzimas citoslicas
Centrifugacin
Principios fsicos de la centrifugacin
Centrifugacin diferencial
Centrifugacin por reparticin zonal
Tipos de rotores
F
c
= m (1-vr) w
2
r
Donde:
V= volumen especfico de la partcula
r= densidad de la solucin
w= radianes/s= 2p/60 x RPM
r= distancia de la partcula desde el centro del rotor
m= masa de la partcula
Centrifugacin diferencial
Centrifugacin por reparticin zonal
Rotor de ngulo fijo
COMO PURIFICAR
ENZIMAS
Se proceder a aislar la enzima de las
otras molculas del medio, utilizando
diferentes mtodos:

- cromatografa
- precipitacin fraccionada
- dilisis y ultrafiltracin
Siempre debe acordarse que:
En el extracto crudo y despus de
cada etapa en una purificacin,
se debe medir la cantidad de
protena y la actividad enzimtica
para poder evaluar la purificacin
realizada.
Precipitacin fraccionada

Fundamentos
Precipitacin por sales (sales empleadas)
Solventes orgnicos (etanol absoluto)
Punto isoelctrico
Por calor
Fuerza inica
pH
Dilisis y Ultrafiltracin

Dilisis: Objetivo
Bolsas de dilisis:tipos
Ultrafiltracin: Objetivos
Tipos de ultrafiltracin
Bolsas de dilisis
Lmite de
Exclusin:
12,400 Da.
2,000 Da.
(benzoiladas)
Sistemas de Ultrafiltracin
Sistemas de Ultrafiltracin
Referencias bibliogrficas para la prxima
clase:
J. M. Gonzles de Buitrago Tcnicas y Mtodos de Laboratorio Clnico.
Elsevier Masson. Barcelona, Espaa. 2010.

M.D. Trevan, S. Boffey, K.H. Biotecnologa: Principios Biolgicos. Editorial
Goulding y P. Stanbury. Arancibia. Zaragoza, Espaa. 1990.

D.L. Nelson AND M.M. Cox Principles of Biochemistry. 5
th
ed. W. H.
Freeman Publishers and Company, New York. 2008.

A.L. Lehninger Bioqumica. Omega S.A. 1989

S.Kocabiyic and I. Ozdemir Purification and characterization of an intracelular
chymotrypsin-like serine protease from thermoplasma volcanicum Biosci.
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