Enzimologa y Estructura de Protenas

(BT5302/ BT7435)



Espectroscopa de Absorcin




Juan Pablo Rodrguez


- 2011 -
I. Estructura de Protenas

Anlisis de Protenas

Espectroscopa de absorcin
Electroforesis, Isoelectroenfoque
Cromatografa:
- Exclusin molecular
- Intercambio inico
- Afinidad
Espectroscopa


Es el estudio de las interacciones de la radiacin electromagntica con
tomos y molculas. Estas interacciones, que incluyen absorcin o
emisin, son pruebas altamente sensibles de las estructuras atmicas
y moleculares.

Dependiendo de la longitud de onda de la radiacin absorbida o emitida,
los mtodos espectroscpicos se clasifican generalmente en:

- Espectroscopa ultravioleta
- Espectroscopa visible
- Espectroscopa infrarroja.
Incluyen cinco componentes bsicos:

i) Fuente de energa radiante
ii) Selector de longitud de onda
iii) Compartimentos para la muestra
iv) Detector de radiacin (convierte la
energa radiante en una seal
elctrica)
v) Sistema que procesa y lee la seal.
Componentes de un Espectrofotmetro
i ii iii iv v
Espectroscopa de Absorcin Molecular.


Toda molcula es capaz de absorber ciertas longitudes
de onda caractersticas de la radiacin electromagntica.

En este proceso, la energa de la radiacin es transferida
temporalmente a la molcula y, como consecuencia de
esto disminuye la intensidad de la radiacin.
donde es el coeficiente de extincin [en M
-1
cm
-1
], c es la concentracin de las especies (en molaridad,
M), y l es el largo del paso de la luz (en centmetros).

Triptofano, absorpcin mxima a 280 nm 3400 M
-1
cm
-1
,
Tirosina, absorpcin mxima a 276 nm y el coeficiente de extincin es menos intenso 1400 M
-1
cm
-1
.
Fenilalanina, absorbe la luz menos intensamente y a longitudes de onda mas cortas.
Los anillos aromticos de triptofano y tirosina contiene electrones p deslocalizados que absorben
fuertemente la luz ultravioleta.
El coeficiente de extincin de un compuesto indica su capacidad para absorber luz. La ley de Beer indica
la absorbancia (A) de luz a una longitud de onda dada:
A = e c l (Ley de Beer)
Triptofano
Tirosina
Fenilalanina
Teora de la Absorcin Molecular.


Las especies moleculares tienen un nmero limitado de niveles de energa,
siendo el nivel ms bajo de energa el estado fundamental.

En equilibrio trmico, casi el 100% de las molculas se encuentran en el
estado fundamental, puesto que existe una gran diferencia de energa
entre el estado fundamental y el estado electrnico excitado
(10
5
10
6
J/mol).

La absorcin de un fotn de radiacin por una molcula se produce solo
si la energa de ste coincide exactamente con la diferencia de energa
existente entre el estado fundamental y el estado excitado.
Luego de un tiempo breve (10
-8
a 10
-9
seg), la especie se relaja
volviendo a su estado basal, cediendo el exceso de energa a
otros tomos o molculas del medio:

- Proceso no radiante

- Reemisin de radiacin: Fluorescencia


M + hm = M* M = especie en estado basal
M*= especie en estado excitado

M* = M + calor
Tipos de transiciones moleculares.


Las molculas experimentan tres tipos de transiciones cuando absorben
radiacin ultravioleta (UV), visible (VIS) o infrarroja (IR):

- Transicin electrnica
- Transicin vibracional
- Transicin rotacional

La Energa Total asociada a un orbital de una molcula est dada por:


E = E
electrnica
+ E
vibracional
+ E
rotacional
Absorcin de la radiacin UV y VIS


La longitud de onda a la que absorbe una molcula orgnica depende de
la fuerza con que estn unidos sus distintos electrones.

Los electrones compartidos en enlaces simples (C-C o C-H) estn unidos
tan fuertemente, que la absorcin ocurre slo en la regin UV del espectro
(l < 180 nm). En esta regin tambin absorben los componentes del aire,
por lo cual sta no es una regin til para hacer mediciones.

Los electrones que participan en enlaces dobles y triples no estn unidos
tan fuertemente, y por lo tanto, pueden ser excitados ms fcilmente por la
radiacin. Presentan picos de absorcin en la regin UV (l > 180 nm).
Absorcin de la radiacin UV y VIS


Los grupos funcionales orgnicos insaturados que absorben en las
regiones UV o VIS se denominan cromforos.

Los electrones no compartidos en elementos como S, Br y I estn
retenidos menos fuertemente que los electrones compartidos en un
enlace saturado. Molculas orgnicas que contienen estos elementos
normalmente presentan bandas de absorcin tiles en la regin UV.
Absorcin de la radiacin UV y VIS


Las molculas absorben radiacin visible de forma tal que promueven a los
electrones a los niveles vibracionales del estado electrnico excitado (E1).
Para promover los electrones a estados electrnicos excitados superiores
(E2), se requiere una radiacin de mayor energa, como la radiacin UV.

Los electrones que contribuyen a la absorcin de la radiacin UV y VIS por
las molculas orgnicas son:
1. Los electrones compartidos que participan directamente en la formacin
del enlace entre tomos y que adems estn asociados a ms de un tomo.

2. Los electrones no compartidos o externos que estn localizados
principalmente alrededor de tomos como el oxgeno, los halgenos, el
azufre y el nitrgeno.
Absorcin de la radiacin UV y VIS.


Las caractersticas de absorcin de una molcula dependen del estado
y del solvente en que se encuentre.

Estado gaseoso, las molculas se encuentran lo suficientemente separadas
para poder rotar y vibrar libremente; por eso se observan una gran cantidad
de picos de absorcin.

En solucin, estado condensado, se limita la libertad de rotacin, por lo que
se borran las lneas debidas a las diferencias en los niveles de energa
rotacional.

En presencia del solvente, las energas de los distintos niveles vibracionales
se modifican de una manera irregular.

Ejemplo, en hexano se aprecian slo los picos correspondientes a las
transiciones electrnicas. En un solvente polar, agua, los picos electrnicos
se mezclan dando un espectro en forma de un pico suave y ancho.
Espectroscopa de Fluorescencia


La fluorescencia es un proceso de emisin en el cual las molculas son
excitadas por la absorcin de radiacin electromagntica. Las especies
excitadas se relajan al estado basal, liberando su exceso de energa como
fotones.

Ya que en el estado excitado parte de la energa se pierde en procesos no
radiantes (transiciones vibracionales), la luz emitida siempre es menor que la
luz absorbida, y la fluorescencia de un cromforo es a una longitud de onda
ms larga que su absorbancia.

La emisin fluorescente es mucho ms sensible que la absorcin de luz a
los cambios del ambiente. Un amplio rango de interacciones o perturbaciones
pueden afectar este estado y por consiguiente el espectro de emisin. Otro
factor a considerar en la fluorescencia es la transferencia de energa entre
residuos.
Espectroscopa de Fluorescencia.


Las ventajas principales de este mtodo son:

a) Su sensibilidad, uno o dos rdenes de magnitud mayor que la
espectroscopa de absorcin, y

b) Los intervalos lineales, los cuales son ms grandes que en la
espectroscopa de absorcin.


Normalmente, el tiempo de vida de una especie excitada es breve
porque hay diversas formas en las cuales un tomo o una molcula
excitada liberan su exceso de energa y se relajan a su nivel basal.

Relajamiento no radiante y
Relajacin fluorescente.
Rango Temporal para el Proceso de Fluorescencia
Transition Process Rate Constant
Timescale
(Seconds)
S(0) => S(1) or S(n)
Absorption
(Excitation)
Instantaneous 10
-15

S(n) => S(1)
Internal
Conversion
k(ic) 10
-14
to 10
-10

S(1) => S(1)
Vibrational
Relaxation
k(vr) 10
-12
to 10
-10

S(1) => S(0) Fluorescence k(f) or G 10
-9
to 10
-7

S(1) => T(1)
Intersystem
Crossing
k(pT) 10
-10
to 10
-8

S(1) => S(0)
Non-Radiative
Relaxation
Quenching
k(nr), k(q) 10
-7
to 10
-5

T(1) => S(0) Phosphorescence k(p) 10
-3
to 100
T(1) => S(0)
Non-Radiative
Relaxation
Quenching
k(nr), k(qT) 10
-3
to 100
Relajacin no radiante


Colisiones entre molculas excitadas y las molculas del solvente.

En estas colisiones, el exceso de energa vibracional se transfiere a
las molculas de solvente: pequeo incremento de la temperatura.

La relajacin vibracional es un proceso eficiente. El tiempo de vida
promedio de un estado vibracional excitado es de aproximadamente
10
-15
s.
Fluorescencia


Las molculas electrnicamente excitadas se pueden relajar a cualquier
estado vibracional del estado electrnico basal.

Las bandas de fluorescencia estn formadas por bandas de longitud de
onda mas larga, (menor energa) que la banda de radiacin de excitacin:
corrimiento de Stokes.

La fluorescencia es uno de los mecanismos mediante los cuales una
molcula vuelve al estado basal despus de que ha sido excitado.

Todas las molculas tienen potencial para fluorescer. La mayora no lo
hace porque su estructura proporciona vas no radiantes de relajacin
de velocidad mayor que la emisin fluorescente.
Este concepto, conocido como la Regla de la Imagen en el Espejo. El espectro de emisin
resultante (rojo) es una imagen especular del espectro de absorcin del cromforo.
El rendimiento de cuantos de fluorescencia molecular (F)
corresponde a la proporcin del nmero de molculas que
fluorescen en relacin al nmero total de molculas
excitadas.


F = Rf / Rf + Rr


Rf, relajacin fluorescente
Rr, relajacin no radiante
Fluorescencia y estructura


Compuestos que tienen anillos aromticos fluorescen, y su eficiencia
cuntica aumenta con el nmero de anillos y su grado de
condensacin.

La fluorescencia se ve favorecida por la rigidez de la molcula; la
cual disminuye la velocidad de la radiacin no radiante de forma que la
relajacin por fluorescencia tiene el tiempo suficiente para ocurrir.

La eficiencia cuntica de la fluorescencia disminuye:

- Con el aumento de la temperatura,
- Con la disminucin de la viscosidad del solvente.

En ambos casos hay aumento de frecuencia de las colisiones.
278nm
295nm
Trp
Tyr
La energa de la radiacin fluorescente es proporcional a la
energa de excitacin absorbido por el sistema y proporcional a la
concentracin de la especie emisora, a concentraciones bajas.

Cuando la concentracin aumenta (absorbancia > 0.05, o T< 90%)
se pierde la linearidad, quedando la fluorescencia bajo la lnea recta:
hay autoapagamiento.

Las molculas de la especie fluorescente absorben la radiacin
producida por otras molculas de la misma especie.
Cambios en las caractersticas espectroscpicas con la formacin de un complejo enzima-sustrato.
La intensidad de fluorescencia del grupo piridoxal fosfato (PLP) en el sitio activo de la triptofano sintetasa cambia
con la adicin de serina e indol, los sustratos.
Esta enzima cataliza la sntesis de l-triptofano a partir de l-serina y un derivado del indol. La adicin de l-serina
a la enzima produce un marcado aumento en la fluorescencia del grupo PLP. La adicin posterior de indol, el
segundo sustrato, reduce esta fluorescencia a un nivel incluso menor que el de la enzima sola. As, la
espectroscopa de fluorescencia revela la existencia de un complejo enzima-serina y de un complejo enzima-
serina-indol.
Fluorescencia:

Ventaja:
Su sensibilidad es uno o dos rdenes de magnitud mayor que
la espectroscopa de absorcin.

Se puede aumentar la intensidad aumentando P
o
, con lo cual
se aumenta la sensibilidad.


F = P
o
F a b c F rendimiento cuntico
de fluorescencia


Absorbancia:

A = log(Po/P)
A = abc
c = k log(P
o
/P) k = 1/ab

Al aumentar P
o
aumenta tambin P, por lo tanto no aumenta la
sensibilidad.
Ventajas y desventajas de la espectroscopa electrnica


Ventajas

1. La absorcin y emisin de luz por los cromforos de las protenas es muy
intensa. Los aminocidos aromticos tienen coeficientes de extincin
relativamente altos.

2. Grupos prostticos presentes en muchas protenas como cofactores
absorben fuertemente en UV y VIS.

3. Se pueden detectar concentraciones muy pequeas de molculas orgnicas.

4. El agua es transparente a radiacin UV y VIS. Se pueden analizar las
molculas biolgicas en soluciones acuosas sin interferencia del solvente.

5. La transicin entre dos estados electrnicos que acompaa la absorcin
UV y VIS ocurre en una escala de tiempo muy breve (10-15 sec). Un gran
nmero de procesos biolgicos pueden ser analizados por espectrocopa
electrnica.
Desventajas.

1. Generalmente no se obtiene una informacin detallada de la estructura de
la molcula.

2. La fluorescencia es muy sensible para analizar cambios estructurales de
macromolculas, pero su intensidad es afectada por la temperatura. No sirve
para estudiar cambios dependientes de temperatura.

3. Debido a la sensibilidad de la espectroscopa de absorcin UV y VIS, la
muestra debe tener una pureza muy alta.