CdL Medicina

Corso ufficiale di Biologia Molecolare del

corso di Biochimica
10 Lezioni:
Marted ore 11-13 Paolo Arosio

Esame: test scritto, discussione orale
Libri
Biologia Molecolare, Weaver RF, McGraw-Hill
editore, 81 Euro



Molecular Biology of the cell, Alberts e coll. 5
ed. Garland, 124 Eur



Biologia molecolare del gene, Watson J.D. e coll.
2009, Zanichelli ed, 91 Eur

Biologia Molecolare
La biologia molecolare una branca
della biologia che studia gli esseri viventi a livello
dei meccanismi molecolari alla base della loro
fisiologia, concentrandosi in particolare sulle
interazioni tra le macromolecole,
ovvero proteine e acidi nucleici (DNA e RNA). Per
biologia molecolare si intendono spesso una serie
di tecniche che consentono la rilevazione, l'analisi, la
manipolazione, l'amplificazione (PCR) e la copia
(clonaggio) degli acidi nucleici.
Relazione tra biologia molecolare, genetica e biochimica in
un'accezione classica dei relativi campi di studio.
Il corso
Scopo del corso: studiare le conoscenze
delle macromolecole e dei meccanismi
molecolari che sono alla base della
conservazione, riparazione, duplicazione
e trascrizione degli acidi nucleici, della
maturazione dei trascritti, degli eventi post
trascrizionali nella sintesi delle proteine, e
del loro targeting in sistemi procarioti ed
eucarioti. Tali conoscenze potranno essere
usate in applicazioni biotecnologiche.
La cellula
La teoria cellulare afferma che tutte le cose
viventi sono fatte di cellule.
Una cellula una entit che ha la capacit
di dividersi e produrre nuove cellule
Per fare questo le cellule devono sfruttare
la nicchia o lambiente in cui vivono

Quattro aspetti di una cellula
Informazione

Contenimento

Azione

Energia

DNA
Lipidi
Proteine
ATP
Energy
Containment Information
Action
Prokaryotes vs. Eukaryotes
The nucleus
Organelles
Organization of Transcription & Translation
Cytoskeletal networks
Endo and exocytosis
1-10um vs. 5-100um
Generally unicellular vs. generally multicellular

procarioti
E. coli (4.639.221 bp, 4300
geni) il modello dei batteri
eucarioti
Cellule pi grandi (10x lineare, 1000x in volume)
organizzate con citoscheletro, membrane intracellulari
Possono fagocitare altre cellule- predatori
Hanno genomi ibridi: nucleare, mitocondrio e plastidi
Hanno genomi molto pi grandi di quelli dei procarioti.
Molti geni regolatori
Molti
compartimenti
per organizzare
attivit differenti
Sintesi delle macromolecole
Carboidrati
lipidi
Proteine
Acidi nucleici
Figure 2-65 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)
Lenergia per la formazione dei legami
proviene dallidrolisi di ATP
Son tutti idrolizzabili
Figure 2-68 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)
I due meccanismi generali per la formazione di polimeri
lineari.
La polimerizzazione di coda pu essere facilmente riparata.
DNA
Very regular structure
Two anti-parallel DNA strands
Held together by hydrogen bonding base pairs
Very stable
Essentially unchanged from cell to cell in an
organism
RNA
Adopts a variety of structures
Often a single strand with self
base-pairing domains
Less stable than DNA
Some RNAs can act as enzymes
Proteins
Proteins are the most versatile class of
macromolecules in the cell
Made of 20 different amino acids
Great variety of potential chemistry
Subject to many other biochemical
modifications that can alter and regulate
their function
Carry out the bulk of cellular activities

Action most duties of the cell are
carried out by proteins
Proteins
have very
diverse
structures
2
o
structures come together to
make 3
o
structures
Categories of Covalent Modifications
Modifications:
Arg: Mono- & Di-methylation

His: Phosphorylation (H4)

Lys: Acetylation
Mono-, Di-, & Tri-methylation
Ubiquitination
Sumoylation

Ser/Thr: Phosphorylation
Proteins are modular
Proteins are typically composed of one or more
functional modules
These modules are termed domains
Domains are stable structures that can
function as independent units
A
B C1 C2
NH
3
+
COO
-
Membranes are composed of 2
layers of oriented phospholipids
Campbell, Fig. 5-12
What does the cell membrane do?
Classes of membrane proteins
DNA
Le basi
Tautomeria delle basi:
Ammino immino
Cheto -enolica
Le coppie di basi
A:T e G:C hanno lo stesso
ingombro trasversale
Gli accoppiamenti causano un
accoppiamento antiparallelo
Stabilizzato da fattori entropici
Da impilamento delle basi
Da legami H (specificit)

Incompatibilit A:C
Solco maggiore e minore
Il solco maggiore offre
informazioni:
A: accettore legame H
D: donatore legame H
M: metile
H:idrogeno
A:T ADAM, T:A MADA
G:C AADH, C:G HDAA
Solco minore:
A:T AHA, G:C ADA
Base flipping
Energeticamente facile
Permette laccesso alle basi per
Metilazione
Rimozione di basi
Verifica complementariet
Strutture DNA
La struttura B la pi
comune
La A pi compatta e fatta
dallRNA
La Z levogira e fatta a
Zig-Zag
Denaturazione del DNA
Bassi sali
Alti sali
La separazione dei due filamenti, denaturazione, reversibile ed
avviene ad alta temperatura. Una alta concentrazione di sali riduce la
repulsione elettrostatica dei due filamenti ed aumenta la stabilit.
Topologia del DNA
Il DNA si arrotola su se
stesso, quello circolare si
superavvolge in topologie
pi compatte che sono
associate ad arrotolamento
positivo o negativo.
Separazione di DNA
La migrazione dei
topoisomeri
dipende dal
numero di
superavvolgimenti
della molecola
Elettroforesi in gel di agarosio del DNA
Topoisomerasi II
ATP dipendente, taglia il doppio filamento
Toposomerasi I
Taglia un solo filamento. La girasi introduce
sopravvolgimenti negativi per facilitare replicazione o
trascrizione
Etidio bromuro
Il DNA un colorante per la colorazione del DNA. La
sua fluorescenza aumenta quando si intercala al DNA .
Causa uno srotolamento e diminuisce il Twist. Il DNA
circolare superavvolto viene srotolato, e quello rilassato
viene superavvolto positivamente
RNA
Differenze da DNA:
Ribosio
Uracile
Singola elica

Funzioni:
Intermediario: mRNA
Raccordo: tRNA
Regolazione: MicroRNA,
siRNA
Enzima: ribosomi etc.
strutture RNA
RNA a doppia elica pu fare solo
struttura A, per lingombro del 2OH
Solco maggiore meno accessibile,
quello minore pi accessibile
Pu formare complesse strutture
secondarie
strutture RNA
Pseudonodi
Appaiamenti non Watson-Crick
Ribozimi
La possibilit di fare strutture
secondarie e la reattivit del
2OH permettono allRNA di
avere attivit enzimatica,
generalmente di tagliare RNA
RNAsi P, processa tRNA
Ribonucleoproteine: RNA
splicing
Ribonucleasi Hammerhead:
tratti di RNA che tagliano
sequenze contigue
Tecniche di biologia molecolare
Clonaggio ed espressione
Polymerase chain reaction, PCR
Elettroforesi su gel
Southern Blotting (DNA)
Northern Blotting (RNA)
Western Blotting (Proteine)

Ibridizzazione
Restrizione
Sequenziamento
Molecular cloning
Introdurre un gene estraneo in cellule
batteriche
Separare le singole cellule
Ottenere colonie da esse.

Risultato: replicazione del gene estraneo.
Si basa sulluso di vettori per la replicazione,
selezione e inserimento del gene
Vettori
Caratteristiche fondamentali:
Replicazione
Siti di taglio unici (polylinker)
Marcatore selezionabile
Facili da purificare
Video
DNA cloning

http://www.youtube.com/watch?v=acKWdNj936o


animazione
E.coli
Plasmide DNA
Gene V
Estremit coesive
Gene V
Batterio
ricombinante
Cellula umana
Plasmide con
DNA ricombinante
Clone batterico in possesso di molte copie del gene umano
Clonazione di un gene
in un plasmide
batterico:
Si isola il DNA da due fonti diverse 1
Si tagliano
entrambi i DNA
con un enzima di
restrizione
2
Si mescolano le molecole di DNA che si uniscono
mediante
appaiamento di basi azotate
3
Si aggiunge DNA-ligasi per attaccare il DNA con
legami covalenti
4
Si clona il batterio 6
Si inserisce il plasmide in un batterio tramite
trasformazione
5
Trasformazione delle
cellule competenti
Polymerase chain reaction:

Da quantit molto piccole di DNA
(fino a 1- poche molecole) si pu
amplificare abbastanza DNA da
vederlo in elettroforesi.

Polymerase Chain Reaction
(PCR)
Video PCR
http://www.youtube.com/watch?v=eEcy9k_KsDI

elettroforesi
Southern Blotting
Southern Blot una tecnica usata per rivelare la
presenza di specifiche sequenze di DNA in una
miscela complessa. Prende il nome dal suo
inventore.
Passaggi:
Taglio del DNA con enzimi di restrizione
Separazione elettroforetica su gel di agarosio
Trasferimento su foglio di nitrocellulosa (blotting)
Ibridazione con una sonda di DNA marcata
Lavaggio e rilevamento della sonda legata al
foglio
Southern blot
video
Membrane hybridization assay
Southern blot
Northern blotting
Northern blotting una tecnica che permette di
visualizzare ed identificare l'RNA purificato da un
campione, in particolare per studiare l'espressione genica
E simile al Southern Blotting, con la differenza che l'RNA
tende a formare strutture secondarie per cui l'RNA deve
essere denaturato e la corsa elettroforetica deve essere
eseguita in presenza di agenti denaturanti.
Passaggi
Preparazione RNA
Denaturazione
Corsa elettroforetica
Trasferimento
Ibridizzazione
visualizzazione
Northern blotting

Video
Western Blotting
Il western blot o immunoblot una tecnica
che permette di identificare una determinata
proteina mediante il riconoscimento con
anticorpi specifici. In generale miscela
viene separata in base al peso molecolare
utilizzando un gel di poliacrilammide.
Trasferita su membrana, incubata con
lanticorpo marcato e visualizzata.

Figure 8-36 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)
Ibridizzazione o annealing
Restrizione
Alcuni producono frammenti con estremit piatte (blunt end) altri
con estremit coesive (5 o 3 protundenti).
DNA sequencing
Il metodo di-deoxy di Sanger
usa la sintesi di DNA da una
DNA polimerasi.
La sintesi di DNA terminata a
nucleotidi specifici dalla
incorporazione di di-deoxy
nucleotidi che non hanno il 3
OH.
Il sequenziamento usato per determinare lordine
dei nucleotidi di una molecola di DNA
analisi della sequenza
Quattro reazioni
differenti producono
frammenti di DNA che
terminano a caso ad
ognuno dei quattro
nucleotidi
Questi campioni sono
separati in elettroforesi
I frammenti pi corti, che
terminano vicino al
primer, corrono pi
veloci dei frammenti pi
lunghi
I sequenziatori
automatici usano
terminatori dideoxy
marcati con quattro
coloranti fluorescenti.
Le quattro reazioni
possono essere fatte
insieme in una reazione
singola.
Fluorescently tagged fragments are resolved
by capillary electrophoresis and detected by a
flourometer.
The DNA sequence is read automatically.
http://www.youtube.com/watch?v=-mtLXpgjHL0

http://www.youtube.com/watch?v=eEcy9k_K
sDI
http://www.youtube.com/watch?v=acKWdNj
936o