Universidad Autnoma de Coahuila

Facultad de Ciencias Qumicas

Simultaneous identification and quantitative determination of
neomycin sulfate, polymixin B sulfate zinc bacytracin and
methyl and propyl hydroxybenzoates in ophthalmic ointment
by TLC.
Jan Krzek, Malgorzata Starek, Anna Kwiecien, Wlodzimierz Rzeszutko
Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis,

Deparment of Inorganic and Analytical Chemistry, Collegium Medicum,

Jagiellonian University Cracow, 9 Medyczna Str, Cracow, Poland.

Alumno: Jess Roberto Rodrguez Snchez

Tcnicas Analticas de Separacin
Dra. Judith Amador
Received 9 April 2000, Revised 11 August 2000
Accepted 9 September 2000

Resumen

Se aplic el mtodo de cromatografa en capa fina (TLC por sus

siglas en ingls) para la identificacin y cuantificacin de sulfato de
neomicina, sulfato de polimixina B, bacitracina zinc y otras
sustancias auxiliares (metil y propil-hidroxibenzoatos) antibiticos
presentes en una pomada oftlmica.

Se utiliz un gel de slice en placas de TLC como fase estacionaria.

Se usaron dos fases mviles; la primera una mezcla etanol-butanolamoniaco 25 %- cloroformo para determinacin de los antibiticos,
mientras que n-pentano- cido actico glacial para determinacin de
hidroxibenzoatos.

Los cromatogramas de los antibiticos se determinaron con una

solucin ninhidrina-etanol; las mediciones densitomtricas se
realizaron por medidas de UV a 550 nm, y para los hidroxibenzoatos
a 260 nm.

Introduccin

El sulfato de neomicina, la bacitracina y la polimixina son ampliamente

usados en oftalmologa. Son usados para el tratamiento de infecciones de
la piel en forma de ungento debido a su nefrotoxicidad.

Estos antibiticos pertenecen a diferentes grupos qumicos y difieren no

slo en su composicin qumica, sino tambin en las propiedades fsicas y
qumicas. La polimixina (A) y la bacitracina(B) en contraste a la
neomicina(C) son antibiticos de estructura peptdica y contienen
diferentes aminocidos, tambin contienen componentes como cido
diaminbutrico (polimixina).

La neomicina es un antibitico aminoglucosdicos que contiene aminoazcares conectados por enlaces glucosdicos.

a menudo juntos o con otros constituyentes y suelen estar con

otros medicamentos o sustancias auxiliares, que pueden
obstaculizar la identificacin o cuantificacin de la materia activa.
El mayor problema est en la separacin de los constituyentes a
partir de la base de la pomada oftlmica.

Los mtodos microbiolgicos, precedidos por una cromatografa

inicial de los componentes individuales son de gran importancia.
La determinacin cuantitativa se basa tambin en mtodos
espectrofotomtricos como el uso del UV.

El objetivo de este trabajo se justifica por la alta demanda de

medicamentos de composicin qumica que contienen estos
antibiticos. Por lo tanto, todava se buscan los mtodos para la
rpida identificacin y cuantificacin de la materia activa y
sustancias auxiliares para fines de control. Este trabajo asegura
datos simultneos rpidos, asegurando al mismo tiempo exactitud
y precisin.

Procedimiento
1. Preparacin de la muestra:
A. Soluciones estndar para soluciones de antibiticos de 0.7 mg/ml se
obtuvieron disolviendo sustancias comparativas en medio volumen de
agua y se llen de metanol hasta concentracin necesaria.
B. Las soluciones de las muestras para anlisis(antibiticos) cerca de 2.0 g
+/- 0.1 mg disolvindose en 30 ml de ter dietlico. Los antibiticos se
extrajeron cinco veces con 10 ml de agua. Los extractos combinados se
llenaron con agua hasta 50 ml.
C. Las soluciones de muestra (agentes conservantes) fueron cerca de 1.5 g
+/- 0.1 mg disolvindose en 40 ml de metanol y se calent en un bao
de agua. A continuacin se enfri.
D. Soluciones estndar para el metil hidroxybenzoato de 0.08 mg/ml y
propil hidroxybenzoato de 0.04 g/ml se obtuvieron disolviendo en
metanol.

2. Anlisis para los antibiticos

A. Aplicar la solucin estndar de neomicina en cantidad de 6 microlitros en
la banda de 1 cm de ancho en la primera placa de 12x5 cm de tamao;
en forma similar la polimixina en la segunda placa; la bacitracina en la
tercera placa. Se desarrollan los cromatogramas hasta la altura de 11 cm
usando la fase mvil metanol-n butanol-amoniaco 25 %, cloroformo
(14:4:9:12) a temperatura ambiente. Se coloca en seco a 100 C durante
1.5 h. Se sumergen los cromatogramas secos en la solucin al 2 % de
nihidrina durante 15 min. y se vuelve a secar a 100C en 5 min.
B. Los cromatogramas deben mostrar tres puntos que se originaron de los
antibiticos particualres. Sus lugares correspondern a los de las
soluciones estndar. Anotar las reas bajo los picos en 550 nm. Calcular
la cinc. comparando las reas de los picos para el estndar apropiado.
3. Determinacin de metil y propil hidroxibenzoatos
Aplicar la solucin estndar y de anlisis en cantidad de 3 microlitros en
cada formacin de banda de 1 cm de ancho en placas de 12x 9 cm de
tamao. Desarrollar cromatogramas hasta la altura de 11 cm usando de
fase mvil: n-pentano- cido actico glacial (66:9) a temperatura ambiente.
Repetir el mismo procedimiento de secado que el paso anterior. Hacer
mediciones de densitometria a 260 nm.

4. Validaciones del mtodo

A. Robustez: Los cambios de parmetros se cromaron en cuenta en el
proceso analtico haciendo nfasis en la eficacia de la extraccin, la
preparacin de la muestra, el tiempo de separacin cromatogrfica,
mtodos de deteccin y cambios en la composicin qumica de la fase
mvil.
B. Lmite de cuantificacin y lmite de deteccin: El anlisis densitomtrico
asegura que los picos desarollados se obtienen a bajo nivel de ruido.
C. Linealidad: Se comprob para seis soluciones de diferente concentracin
que oscila de 50 a 150 % con respecto a los resultados esperados.
D. Recuperacin: La precisin del mtodo se expres en % de recuperacin
para el analito aadido a una cantidad conocida de muestra.
E. Precisin: La compatibilidad de los resultados obtenidos para el modelo de
la medicina fue investigado por tres niveles de concentracin y 8
resoluciones adoptadas para las sustancias apropiadas.

Resultados y
Discusiones

I. Anlisis para los antibiticos

Se encontr que las condiciones de separacin y de deteccin

llevan a manchas compactas y duraderas para los
componentes individuales, indicando, de este modo una buena
separacin. En la determinacin de los antibiticos, la fase
mvil consisti en metanol-n butanol-amoniaco 25%cloroformo(14:4:9:12). No se observ ninguna influencia
adversa de la fase estacionaria.

Anlisis indicaron que los cromatogramas deben ser

desarrollados hasta la altura de 11 cm por alrededor de 90 min.
Desarrollar cromatogramas en camino ms corto lleva menos
tiempo, pero las diferencias en los valores de Rf no son
satisfactorios, lo que ocasiona problemas en el anlisis
cualitativo y cuantitativo.

El mtodo propuesto permiti un alto contraste en los

cromatogramas que se obtuvieron ( fondo blanco y manchas rojas).
Esto revela la altura de los picos individuales. Se intentaron
visualizaciones con reactivos en spray pero no se pudo observar el
contraste.

N= Neomicina
P= Polimixina
B= Bacitracina

II. Anlisis para metil y propil- hidroxibenzoatos

La fase mvil consisti en n-pentano-cido actico glacial (66:9).

Se encontr que los mejores resultados se obtuvieron mediante el
uso de mediciones densitomtricas a 260 nm. En este rango el
resultado no se vio afectado por otros constituyentes. Los
cromatogramas se desarrollaron hasta la altura de 11 cm durante
60 min.

M= metil-h
P= Propil-h

III. Tabla de los parmetros generales para la determinacin de

los analitos.

Los siguientes parmetros: reas de los picos, Rf, colores,

durabilidad de las mediciones, porcentaje de recuperacin para los
componentes determinados; los lmites de cuantificacin y lmite de
deteccin; la linealidad (obtenidos por regresin lineal), y la precisin
( desviacin estndar S) son resumidos en la tabla siguiente.

La recuperacin fue muy alta y oscil al 98.08 %. El proceso de

preparacin de la muestra es decisiva para obtener resultados tan
altos de recuperacin. La precisin se expresa en los trminos de
desviacin estndar. El nivel de confianza del 95 % de cada resultado
individual (x) se encuentra dentro del rango x +/- 2S. Es posible
afimrar que los resultados obtenidos se encuentran cerca de la
media aritmtica significando que no tiene errores aleatorios.

La fiabilidad del mtodo presentado anteriormente se confirm

mediante la comparacin de los resultados en la tabla para los
componentes
individuales
y
los
parmetros
estadsticos
correspondientes. Los resultados indican que la composicin qumica
declarada por el fabricante no difiere de uno real.

Conclusiones

Se desarroll un mtodo densitomtrico cromatogrfico rpido,

sencillo y preciso para la determinacin simultnea de neomicina,
polimixina y bacitracina zinc y metil y propil- hidroxibenzoatos en
un unguento para los ojos. Es posible identificar y determinar
tanto la materia activa y sustancias auxiliares. Sobre la base de
las ventajas del mtodo presentado anteriormente y sobre los
resultados obtenidos para la medicina compleja se puede conlcuir
que el mtodo ofrece una alternativa de herramienta til para
HPLC y mtodos microbiolgicos.