*

Javier Carrasco
Anthony Villalobos
Edward Veliz
Guissupe Nuez
Paolo Minaya

12070185
12070055
12070172
12070154
12070152

Determinacin de benzoato cafena y

sacarina en bebidas energizantes
AOAC 979.08

Principio
Se cuantifica de forma simultanea al benzoato, cafena y
sacarina por HPLC utilizando cido actico como fase
mvil. Puede interferir colores artificiales y sorbatos,
espacios en blanco de bebidas que contengan color o
sorbato. De no tener se analiza con 2 fases mviles
diferentes de isopropanol y cido actico por el mtodo
de adiciones estndar

Instrumentos y reactivos
Lquido cromatogrfico
* Waters associates ALC /GPC con solvente 6000
* Inyector modelo U6K
* Detector UV 254nm
* Registrador de banda (Houston Omni Scribe)
* Columna C18 uBondapak 300x4 (id) con un caudal de 2mL
* Sensibilidad del dector ajustable 0.02 a 0.05 AUFS

Fase mvil
La solucin es 20% cido actico (v/v) tamponeado a pH
3.0 con NaAc. Se modific con 0-2% de isopropanol para
obtener una resolucin y tiempo de retencin de
referencia y los estandares mixtos cada 10 minutos. La
solucin es estable de 2 a 3 das . Desgasificar antes de
usar

Soluciones estndar
Las soluciones estndar se preparan de forma individual
para cada componente de pureza conocida para dar las
siguientes concentraciones Na sacarina 0.50 mg/ml ;
cafena 0.050mg/ml ; y benzoato de Na 0.50 mg/ml . Se
utilizan estas soluciones para determinar la sensibilidad
para la respuesta del detector y tiempos de retencin de
estndares individuales

Soluciones estndar mixtos

Se prepara soluciones que contengan 0.50 mg/ml de Na
sacarina, 0.50 mg/ml de benzoato de Na , y 0.050 mg/ml
de cafena. Se utilizan estas soluciones para optimizar las
condiciones de LC para resolucin completa de los 3
componentes y para cuantificar.

Preparacin de la muestra

*Bebidas carbonatadas:

Se desgasifica por agitacin

o tratamiento ultrasnico. Si es libre de partculas
interferentes, se inyecta directamente.

*Bebidas que contengan partculas:

Filtrar a travs
de filtro Millipore (0.45 um), desechando los primeros
mL . Si hay muchas partculas se debe centrifugar. Luego
se inyecta directamente

Determinacin
Se inyecta un volumen conocido (10uL) de solucin
estndar por duplicado. La altura mxima debe estar de
acuerdo con ser menor de <=2.5% . Inyectar un volumen
conocido de la muestra (10uL) por duplicado. Mida la
altura de picos de componentes estndar y de muestra.
% componente = C *(H/H)*(V/V)*0.1
C= concentracin de estndar mg/ml
H y H = altura de pico d el amuestra y std
V y V = volumen inyectado en uL de muestra y std

*Este

procedimiento tiene por

objeto describir la metodologa
analtica para la separacin y
cuantificacin de cafena en
bebidas energizantes utilizando
el mtodo de cromatografa
liquida de alta eficiencia HPLC
AOAC 97908.

*Cantidad

de platos (N): es una medida de la

eficiencia de la columna.

N = 16

TR ^(2)
Wb

N =5.54 TR ^(2)
W50

*TR es el tiempo de reaccin de la sustancia.

*Wb es el ancho de pico en su base.
*W50 es el ancho del pico a la mitad de la
altura.

*Resolucin

R, se calcula por cada par de

picos adyacentes como:
R =

(t2-t1)
(w2+w1)

*t2

y t1 corresponden a los tiempos de

retencin de los picos 2x1, w2 y w1 a los
anchos de picos medidos en su base.

Cromatografo

liquido de alta eficiencia

con bomba cuaternaria, degastificador
en
lnea
para
cuatro
canales,
automuestrador y detector de arreglos
de diodos o longitud de onda variable
con software para procesamiento de
datos marca Agilent.

Balanza analtica de sensibilidad 0.1mg.

Columna de fase reversa C18 ZORBAX
Eclipse XD8.C18 4.6x150mm, 5m.

Sistema

para purificacin de agua MIIQ

Academic maca MLLIPORE.

Potenciomento.
Bao de ultrasonido.

Sistema

para filtracin de solventes en

vidrio.

Membranas

para filtracin e solventes

marca Whatman de Nylon de 47mm de
dimetro y 0.2um de tamao de poro o
equivalente.

Balones aforados de 100mL y 20mL clase A

Pipetas volumtricas clase A de 5, 10, 20,
30, 50mL.

Microesptula en acero inoxidable.

Membranas

para filtracin de muestras

tipo mixto (Nylon) de 25mm de dimetro y
0.45um de tamao de poro Whatman o
equivalente.

Tubos de vidrio con tapa.

Viales con tapa para inyector automtico.
Septas para inyector.
Bao de ultrasonido.
Potencimetro con rango de medicin 0.00
a 14 unidades, exactitud +/- 0.01 unidades
y precisin 0.01 unidades.

oIsopropanol grado HPLC.

oAcido actico.
oAcetato de sodio trihidrato R.A.
oMetanol grado cromatografico.
oAgua ultrapura. Agua resistencia
10megaohms/cm (como mnimo).

especifica

Fase Mvil.

Solvente

A: CH3COOH 15% ajustada a pH

3.0 con solucin saturada de acetato de
sodio.
Fibra con ayuda de vacio la solucin
resultante a travs de filtro mixta de 0.2um.

Solvente

B: Isopropanol HPLC. Filtro con

ayuda de vacio la solucin resultante a
travs de filtro mixto de 0.2um.

Cafena R.A SIGMA (Estndar de trabajo).

Cafena USP
Muestra con valor asignado FAPAS
equivalente.

A) Soluciones estndar:
Solucin estndar de

cafena[1] 500mg/l.
Pesar 100mg de cafena, disolver con agua,
transferir a una baln de 200 y completar
a volumen con agua HPLC.

Solucin estndar de cafena[2] 250mg/l.

Tomar 50ml de solucin[1], transferir a un
baln de 100ml y completar el volumen
con agua HPLC.

Solucin

estndar de cafena[3] 100mg/l.

Tomar 20ml de solucin[1], transferir a un
baln de 100ml y completar el volumen con
agua HPLC.

Solucin

estndar de cafena[4] 60mg/l.

Tomar 10ml de solucin[1], transferir a un
baln de 100ml y completar el volumen con
agua HPLC.

Solucin

estndar de cafena[5] 25mg/l.

Tomar 5ml de solucin[1], transferir a un
baln de 100ml y completar el volumen con
agua HPLC.

B) Estndar de verificacin (QC).

Un analista autorizado debe preparar
paralelamente un estndar de 250mg/l
como se describi en A).
Despus de inyectar todos los estndares, el
estndar de 250mg/l debe ser inyectado
para
hacer
una
verificacin
de
la
calibracin.

Para el anlisis de conservantes se

requieren
las
siguientes
condiciones
ambientales: Temperatura del ambiente y de
las soluciones de estndares y muestras
entre 10 y 25C y humedad relativa entre 40
a 80%, requerimientos elctricos 110voltios.

A) Bebidas carbonatadas.

Desgasifique por agitacin o tratamiento con

ultrasonido. Filtre a travs de membranas
tipo mixto de 0.45um para filtracin de
muestras,
descartando
los
primeros
mililitros de filtrado. Transvase a un vial
para automuestrador Agilent.

B) Bebidas que contengan partculas.

Filtre a travs de membranas tipo mixto
de 0.45um par filtracin de muestras,
descartando los primeros mililitros de
filtrado. Si hay gran cantidad de
partculas presentes en la muestra,
centrifugue antes de filtrar. Transvase a
un vial para automuestrador Agilent.

C) Muestra con valor asignado

Paralelamente prepare la muestra de
valor
asignado
de
acuerdo
al
procedimiento descrito en A y B.

1)

Preparacin de la columna
2) Funcionamiento del cromatografo
A) Configuracin instrumental

liquido

- Bomba cuaternaria

Desgasificador en lnea
Automuestreador
Detector de ultravioleta visible de
longitud de onda variable
Software para manejo de la seal
instrumental

B) Condiciones cromatogrficas

- Columna de fase reserva

- Fase mvil: solvente A (CH3COOH 15% ajustada a ph 3 con
solucin saturada de acetato de sodio ) , solvente B
(isopropanol)

- Volumen de inyeccin : 10 ul
- Temperatura de columna: 20 C
- Tiempo de corrida: 10 minutos
- Flujo: 2 ml/min
- Longitud de onda: 254 nm

3) Secuencia de inyeccin

- Inyectar una solucin blanco de fase mvil en la primera inyeccin

seguido de un blanco de reactivos (agua HPLC)

- Inyectar los estndares de trabajo de 25 a 500 mg/L preparados

- Inyectar una solucin blanco de reactivos (agua HPLC) despus de la
curva de calibracin

- Inyectar estndar de verificacin de 250 mg/L

- Inyectar una solucin blanco de reactivos (agua HPLC) despus del
estndar de verificacin

- Inyectar las muestras de anlisis y la muestra con valor asignado

cuando este disponible

- Inyectar estndar de verificacin de 250 mg/L

4) Anlisis de datos

- Realizar la curva de calibracin correlacionando el rea de los

estndares de los conservantes con la concentracin de cada
uno

5) Medida de la concentracin de cafena en las muestras

- Una vez realizada la curva de calibracin se procede a leer

las muestras

- Realice la cuantificacin por el mtodo de estndar extremo

1) Aseguramiento de calidad del mtodo

- La curva de calibracin se lee cada vez que se realice un anlisis y se
-

determina su coeficiente de correlacin, la pendiente y el intercepto

Realizar la carta de control con el estndar de verificacin
Verificar que los blancos estn exentos de toda contaminacin
Los tiempos de retencin de las muestras estn dentro del valor
asignado al estndar 2.5 %
Verificar que los picos cromatograficos cumplan la relacin
seal/ruido
El coeficiente de variacin de los duplicados de un anlisis de cafena
en bebidas energizantes no debe exceder el coeficiente de variacin
mximo aceptable de acuerdo a la ecuacin de Hortwitz

2) CRITERIOS DE ACEPTACION O RECHAZO

Parametro

Rango
Accion de tomar en caso de falla
Desempeo del sistema cromatografico
Platos teoricos
3000
cambiar columna
Resolucion
0.8
cambiar columna
Simetria
0.8 a 1.2
cambiar columna
Desempeo de la curva de calibracion
Revisar preparacion del estandar
Coeficiente de correlacion 0.999
Repetir curva de calibracion
Carta de control
La muestra control o la muestra con valor asignado Revisar preparacion de la curva de
debe encontrarse dentro 2 desviaciones estandar calibracion, revisar calculos y repetir el
de la carta control
lote de analisis

Parametro
Tiempo de
retencion

Rango

Accion de tomar en caso de falla

Analisis de muestras

Valor asignado al estandar

2.5 %

Revisar la preparacion de la fase movil y realizar

adicion de estandar

El coeficiente de variacion de los duplicados no debe exceder la maxima permitida por la

ecuacion de Horwitz: RSDr=2(1-0.5logC)
Coeficiente de
Concentracion mg/l variacion maxima
aceptable

50

8.88

300

6.78

500

6.27

Verificar la homogeneidad de la muestra,

repetir el analisis
Verificar la homogeneidad de la muestra,
repetir el analisis
Verificar la homogeneidad de la muestra,
repetir el analisis

3) Criterios Normativos
El valor establecido en la ficha tcnica del producto o en la
tabla nutricional
EXPRESION DE RESULTADOS
Los resultados se expresan en mg/l de muestra
RANGO DE MEDICION
Intervalo lineal para cafena 0-500 mg/L

U
Estandar de trabajo

Descripcion

Valor (x) Incertidumbre estandar u(x)

Pureza
101.24%
Pendiente
6.17
Calibracion
Intercepto
34.2
Precision
Validacion metodo 500 mg/L
Recuperacion Validacion metodo 98.6
Lectura de muestras Precision del inyector 10 ul
u( C )/C = 0.015

0.04
0.012
0.5
1.18 mg/L
0.3535
0.025

Incertidumbre
estandar
relativa u(x)/x

0.0003951
0.001945
0.0146
0.00236
0.003585
0.0025

* Limite de Cafena permitido

Varia de pas en pas, pero el limite permitido se encuentra entre los 100 a 180mg/L

* Exceso de cafena en la Salud

La cafena, tiene un efecto estimulante. Tomando entre 75 a 150 mg de cafena, el cuerpo
eleva su
temperatura, el ritmo respiratorio y el nivel de cido gstrico en el estmago.
El exceso de cafena mas de 400 mg, altera el sistema nervioso, produciendo estados
de nerviosismo, irritabilidad, ansiedad e insomnio, a parte de empeorar el pulso y el control
de los movimientos. Como elemento activador, tiende a acelerar el ritmo cardaco, y puede
producir incluso sudoracin.
El abuso prolongado de cafena (8 o 9 tazas diarias), puede ser causa de lceras gstricas, y
derivar en subidas del nivel del colesterol, as como en insomnio, ansiedad y depresin crnicos.
El consumo de grandes cantidades de cafena en poco tiempo (5000 mg) puede llegar a producir
la muerte (igual estamos hablando de unas 40 tazas bien cargadas de caf).
El organismo se adapta al consumo habitual de cafena, necesitando ms cantidad de esta
sustancia para alcanzar un mismo nivel de activacin.
En estos casos, se produce un cierto nivel de dependencia, que se refleja en irritacin,
cansancio, depresin y somnolencia. Por eso, si tenemos necesidad compulsiva de tomar caf, los
mdicos recomiendan reducir gradualmente el consumo.