Artculo Cientfico:

Evaluacin por Western Blot,

Inmunofluorescencia Indirecta y
ELISA
de Perros Infectados con Leishmania
(Leishmania) infantum
Integrantes:
Rosa Maria Rodriguez
Andrea Perez
Deysi Granda

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N
T
R
O
D
U
C
C
I
O
N

OBJETIVO
Evaluar el desempeo de las pruebas
empleadas en Colombia para el diagnstico de
la leishmaniasis visceral canina y adaptar una
tcnica de Western blot empleando animales
experimental y naturalmente infectados.

MATERIALES Y MTODOS
Perros inoculados experimentalmente
Leishmania infantum:
G1: 3 perros cada uno con 106
promastigotes
G2: 3 perros cada uno con 104
promastigotes
Cepa MCAN/COL/98/CAT por va
(IV)
4 perros con 104 parsitos va
(ID).

con

Sometieron:
2, 4 y 8 meses post
inoculacin
(mpi)
a
valoracin clnica, toma
de sangre, aspirados de
ganglio linftico poplteo y
cultivo en medio 3N.

Los sueros fueron alicuotados y

almacenados a -20C.

MATERIALES Y MTODOS
Perros inoculados
Trypanosoma cruzi:

experimentalmente

3 perros con tripomastigotes de

la cepa MHOM/CO/SPR por
va IV con 2 x 10 parsitos por
kg de peso.
4

2
perros
con
la
cepa
MHOM/CO/DA por va IV por
va IV con 2 x 10 parsitos por
kg de peso.
4

con

Sometieron:
15 das, 1, 2 y 4 meses
post
inoculacin
a
valoracin
clnica, toma de sangre
de la vena ceflica para
prueba
de
microhematocrito y para
la obtencin de sueros.

MATERIALES Y MTODOS
Sueros controles positivos y negativos:
5
sueros
de
perros de zona
endmica.

16 sueros de perros
de la ciudad de
Bogot D.C.

Todos fueron confirmados

parasitolgicamente
por
impronta y cultivo de
muestras
de
ganglio
linftico poplteo, hgado,
bazo y mdula sea.

MATERIALES Y MTODOS
Sueros de reaccin cruzada con otros parsitos;
10 muestras de sueros de perros infectados con:

3 Babesia spp.
3 Erhlichia spp.
2 Dirofilaria spp.
2 Leishmania (Viannia) spp.

Sueros de perros de zona endmica y no

endmica:
Se colectaron muestras de sangre:
150 en zona endmica
40 en zona no endmica

MATERIALES Y MTODOS
Inmunofluorescencia
indirecta

ELISA

Western Blotting

Se empleo promastigotes
de Leishmania
infantum y un conjugado
anti-Ig G canina marcado
con fluorescena a la
dilucin de 1:32.

Se empleo un lisado de
promastigotes de
Leishmania infantum con
una concentracin de 7,5
/ml y diluciones de suero
de 1:600.

Se emplearon diluciones
seriadas de los sueros
desde 1:16 hasta 1:4096
y el punto de corte fue
establecido en una dilucin
t1:32.

Se emple un conjugado
anti-Ig G canina marcado
con fosfatasa alcalina a la
dilucin 1:6000. El punto de
corte fue establecido a un
valor de absorbancia t
0.421.

Se empleo un lisado de
promastigotes de
Leishmania infantum cuya
concentracin de protena
fue medida por el mtodo
de Bradford (29) empleando
5 g por carril. La
separacin por
electroforesis se
llev a cabo en geles de
poliacrilamia al 12% con
SDS 0,1 %. La dilucin de
suero empleada fue de
1:200 y del conjugado de
1:20000.

RESULTADOS
Respuestas clnica y parasitolgica variada
dependientes del tipo de inculo y de la fase de
infeccin.
10 ^ 6
10 ^ 4

IV

Perros sintomticos y
asintomticos

10 ^ 4

ID

Perros sintomticos

No se logr demostrar la presencia de amastigotes en 3 de los 10 perros

inoculados experimentalmente.

POR WESTERN BLOT

Protozoo

L. infantum

Infectados experimentalmente

Reconocieron 15 fracciones antignicas

entre 10 y 123 kDa

Infectados naturalmente

Reconocieron 9 fracciones antignicas

adicionales.

T. cruzi

Reacciones
cruzadas en 8
bandas

64 % sintomticos
37% asintomticos

Erlichia spp.
Babesia spp
Dirofilaria spp.
Reconocieron
nicamente las
bandas 50 y 69 kDa

(+) WB

L. (Viannia)

No se observ
reaccin cruzada
con la fraccin
antignica de 13
kDa (conocida
nicamente en L.
infantum)

Sanos

Reconocieron las
bandas 69, 75 y 123
kDa.

MUESTRAS DE PERROS PARASITOLOGICAMENTE CONFIRMADOS

77% (+) a WB
45% (+) a WB, pero NEGATIVAS parasitologicamente a pesar de la
infeccin experimental.

Animales infectados experimentalmente con L. infantum

45.4% (+) IFB y WB
67.5% de los perros no infectados, dieron NEGATIVO a esas dos
pruebas.

Por ELISA y WB se encontr que para estas dos pruebas de los animales
infectados experimentalmente fueron POSITIVOS el 48.4% y negativos el
57.5% de los perros no infectados.