Comparison of in vitro and in vivo

systems to study ica-independent

Staphylococcus aureus biofilms

Daiane Resende

Introduo
MRSA

Infeces hospitalares e
comunitrias

Biofilme

Fator de virulncia

o Patognese
o Dispositivos invasivos
o Matrix extracelular e protenas do plasma

Protenas de adeso
MSCRAMM

S. aureus

a surface components
(microbial

recognizing adhesive matrix molecules)

Lower et al., 2011

Introduo
S. aureus

2 tipos de biofilmes
ONeill et al., 2007

o Dependentes de ica
Susceptibilidade
(MSSA)
Protena de adeso intercelular Meticilina
(PIA)
poly N- acetilglicosamina (PNAG)
o Independentes de ica

Operon
ica

ONeill et al., 2007

Resistncia Meticilina
(MRSA)
Mediado por outras
Composio
protenas e
modulao dos biofilmes
ica-independentes
No elucidada

Otto,

Introduo
Biofilme ica-independente
o Protena G de superfcie do S. aureus (SasG)
o Protena de superfcie plasmin-sensitive (Pls)
o Protenas ligantes de fibronectina A e B (FnBPA e

FnBPB)
o Protena estafiloccica A (Spa)

Acumula
o do
biofilme

Introduo
Outras protenas Acumulao de biofilme de

S. aureus
o Autolisina

AtlA
Complexo e multi
o Efeito divergente Agr quorum-sensing
fatorial
Melhor entendimento

Formao, acumulao
e desprendimento do biolfime
o Sistema de modelo de biofilmes
o In vitro e in vivo
o Micorotitulao em placa, estruturas 3D (confocal),

real-time, citometria de fluxo, modelos

experimentais
o Poucos estudos comparativos

Objetivos
Comparar:

Espectrofotome
tria baseado
em
microtitulao
em placa

Modelo murino
de corpo
estranho

Formao e acumulao do biofilme de S. aureus

Material e Mtodos
S. aureus

Material e Mtodos
Biofilme independente de ica
o Proteinase k

Isolados e construes
o 12% glicerol a 70C

Aprovado do CEP do RJ

Material e Mtodos
Formao in vitro formao em superfcie

inerte
Incubadas
20h a 37
TSB 1%Glicose em
Shaker 37 18h

Diluio 1:100

Sobrenadante
removido

20L suspenso bacteriana

Placas de ELISA

Secadas e fixadas a
65C por 1h

NaCl

Lavado 2x

Cristal
violeta

Corado

Abiofilm

NaCl

Lavado 2x

DO 570nm

Material e Mtodos
DO 570nm

Agrowth
Diluio 1:100
TSB 1%Glicose em
Shaker 37 20h

Unidade de bifilme: Abiofilm/Agrowth

Material e Mtodos
Determinao de Produo de Biofilme
Controle negativo

S. pyogenes 75194

(UB=0,115)
MRSA
o No produtor
o Produo fraca

UB 0,230
UB > 0,230 e 0,460
o Produo moderada
UB > 0,460 e 0,920
o Produo forte
UB > 0,92

Material e Mtodos
Microscopia Confocal
formao de biofilme in vitro
o Mutante agr (Knockout)
o Amostra complementar rnaIII derivada da NY

19335
Produo de biofilme = descrito

anteriormente
o 25nM SYTOn9 DNA-intercalating 15min. no

escuro

Formao de biofilme in vitro em superfcies

cobertas com fibronectina humana ou soro

50l/ml fn humana (fase

slida): 0,01M PBS
200 l/m soro humano pct
saudveis

Incubadas 1h
a 37
deixadas 18h
a 4C

PBS
lavadas 2x

o Lavagens no realizas em placas tratadas com soro

oEnsaio de biofilme
modelo de microtitulao em

placa

Formao de biofilme in vitro na

superfcie do cateter intravenoso
BMB9393 (forte)Fase exponencial de
crescimento : TSB 1%
NY9335

10 l

crescimento : TSB 1%
glicose
(fraca)
104 UFC

1 cm
CVC

20h

Lavado 2x 1 ml
PBS

Sonicao
10 min
1 ml TSB

TSA

Formao de biofilme in vivo

MNY19335

> habilidade de acumular

biofilme em superfcies inertes
o Padro
o Complementada com rnaIII

Menos animais sacrificados

o agr
o NY19335
o BMB9393
Kadurugamuwa et al., 2003;
Weiss et al., 2009, com
modificaes

Formao de biofilme in vivo

Ketamina e
Tiopental

BALB/c macho
6-8 semanas

Pelo
raspado e
anti-sepsia
com iodo

2 ou 3
fragmentos
implantados
em cada
animal

Lmen do
CVC

crescimento na
fase exponencial
(106 UFC/10 l)

Sonicao
10 min
sacrificados
depois de trs
ou nove dias e
o segmento de
CVC retirado

Lavado 2x 1
ml PBS

1 ml TSB

TSA

Material e Mtodos
Anlise estatstica
Superfcies cobertas com Fn e no cobertas
o Valor de cada isolado
N=UBfn/K
K =UBfn /UBin

Students t-test
o Mdia entre os UB

Normalizado (N)

Resultados : Tcnicas in vitro

MRS
A

Fn
Todos isolados capazes
de produzir biofilme em
superfcie inerte

Sor
o

Capacidade
Amostras de
acumular
menos
biofilme
, trs
aderentes,
isolados

fcies de
acumulao
e
remover
seis no

Capacidade
de
acumular
biofilme
3x
(P<0,0001)

Resultados : Tcnicas in vitro

Complementa
o rnaIII
Cepa
Mutao
padro
agr

Superfcie Inerte

Confo
cal

Resultados : Tcnicas in vitro

Construes
agr
Superfcie
inerte

Fn

Soro
Agr mutante
capacidade de formar
uma camada mais
grossa de biofilme

Resultados : Tcnicas in vitro

Amostras
Clnicas Forte e
Fraca

Superfcie
inerte

Fn

Resultados: Tcnicas in vitro

Sor
o

Catete
r

Resultados:
Tcnica
in
vivo
> 90%
Aps 3
dias

Resultados: Tcnica in vivo

Superfcie
inerte

Soro

Fn

In
vivo

Construes
agr

Resultados
correspondent
es in vitro e in
vivo

Resultados: Tcnica in vivo

Forte e Fraca

Resultados
correspondent
es in vitro e in
vivo

Discusso
Infeces crnicas
o Biofilmes
o Dificuldade teraputica

Modelos de formao/acumulao de

biofilme
o Micro titulao em placa
o in vitro
o in vivo

Discusso
Inesperado Biofilme do S.aureus
o Muitas protenas de superfcie

(formao/acumulao)
o Ausncia de exopolissacardeos

o Cada isolado especializado tipo de matriz

Ambiente

Isolados clnicos e produtos agr de MRSA

o Habilidade de formao e acumulao de

biofilme
o in vitro e modelo murino

Discusso
MRSA acumulao moderada a forte
o in vitro aculuao com Fn
o Similar a outros estudos
FnBPAB essenciais

RNAIII agr regulador negativo de

protenas de superfcie
Construes sem agr

aculuao de biofilme

Cepa padro
Complementada com RNAIII

Discusso
Superfcies cobertas com soro aumento de

acumulao
Fcil desprendimento
No recomendado

Modelo murino boa correlao com

resuldaos in vitro
Isolados clnicos e construes agr

Microtitulao em placa recoberto com Fn

Bom modelo de estudo bifilmes ica-independente

Concluso
Poucos estudos comparam modelos de biofilme
Resultados podem ser diferentes dependendo do modelo
Placas com soro
O estudo mostra boa correlao entre o modelo in vitro e in

vivo
Recomendam o uso de microtiluao em placa para biofilmes

ica-independente polulao numerosa

Modelo murino fcil reproduo
Confirmao dos dados in vitro

Achei
que
nunca
acabaria
!

Obrigada!!!!!