Benemrita Universidad Autnoma de Puebla

Facultad de Ingeniera Qumica

Colegio de Ingeniera en Alimentos
Ingeniera Bioqumica
Extraccin y Purificacin de Enzimas y otras protenas a gran escala
Integrantes:
Ana Laura Martnez Gallardo
Ana Carla Regis
Gabriela Flores Cruz
Alma Karina Len Teutli
Fabiola Meneses Guarneros

INTRODUCCIN

Tcnicas de
purificacin
de protenas

Fermentacin

Purificacin
de protenas
a partir de
cultivos
microbianos

EXTRACCIN POR MTODOS QUMICOS

 lcalis

A gran y pequea escala.

Saltn (1964)

Wade (1968)

Bacterias

grado de
hidrlisis, ms
componentes
son liberados de
la membrana

Aisl Lasparraginasa

Someter a pH
alcalino (1112.5/20 min)

Inactiva proteasas

xito de tratamiento
depende de
estabilidad de la
enzima
contaminacin
por pirgenos

 Lisozima y EDTA

Enzima que
hidroliza enlaces
-1-4-glicosdicos

Las bacterias
Gram positivas
(mucopptido
extendido por la
pared dando
rigidez) son ms
susceptibles.

A pequea escala, ya que el

costo es

Para la ruptura de
Gram negativas
se necesita aadir
EDTA (quela
cationes
divalentes para
desestabilizar la
pared)

 Detergentes
Compuestos inicos
Lauril sulfato sdico
(aninico)
Bromuro de dicetilamonio
(catinico)
Tween y Triton

Condiciones
Fuerza inica pH apropiado
(formacin de micelas)
Constituyentes lipoproteicos
se solubilizan
Membranas permeables
Dependientes de pH y T

Reactivos
Disociacin de
lipoprotenas
(desnaturalizacin,
precipitacin e
hidrlisis)

Inicos

Cromatografa de
intercambio inico

Para
defectos

 Shock por Enfriamiento

Reduccin rpida de T
(0C)

A pequea
escala

Bacterias Gram negativas:

sensibles

Limitaciones: choque fro

nulo en suspensiones
celulares (108/mL) y
bacterias son susceptibles
en fase de crecimiento
exponencial

 Shock Osmtico
Lavado

Solucin
tamponada
Liberar del medio
de cultivo

smosis

Dispersin
de pasta en
agua

Introducir en una
solucin
tamponada (20%
sacarosa)
Centrifugacin

4C
Liberacin de
constituyentes
celulares por el
de P.O.

Sonicaci
n

Cizalla
slida

Mtod
os
Fsicos

Cizalla
lquida

Congelacin
Descongelac
in

Trituracin
* Agitacin
con
abrasivos

1.- Sonicacin
Ultrasonido:
sonidos del odo
humano
Zonas de
compresi
ny
rarefacci
n

Burbujas
comprimi
das

US en
lquidos:
Cavitaci
n
Ondas de
choque

Sthaphylococ
ci:
RESISTENTE

Sistemas de
transporte de
electrones:
Protenas de la
membrana
MAYOR EXPOSICIN
PARA
SOLUBILIZARLO

 til
Verstil
No para
grandes
volmenes

pH

t de

exposicin

F(x)

Fuerza
inica
del
medio

Liberacin
de
protenas
limitada
Daos
celulares

Aadido a
ruptura
celular

2.Congelacin y
Descongelaci
n

Prdida
de
actividad
enzimti
ca

Proteasas

Streptococ
cus lactis
(30C-10
das)

Cambio
s de
estructu
ra
enzimti
ca
Catalasa:
* Cambio no
muy notorio
--:DISMINUCI
N DE ACTIVDAD

*PROBLEMTICO

3.- Cizalla slida

Buchner y
Hahn (1903)

Para liberar
enzimas

Mtodos
E
n
z
i
m
a
s

Pasta de
bacteria
s

Congel
a

Presin

Fraser
(1951)

Hughes
(1951)

Fly
press

Endoespora
s
bacterianas

Congelacin
Descongelacin

Prensa

No a gran
escala

Recuperacin casi
completa

Clulas
congeladas

Fuer
za
de
cizall
a al
pasa
r por
un
orific
io
pequ
eo

Pren
sa

Sacharomyces
cerevisiae

Obte
nci
n de
enzi
mas

Obtencin de
paredes
bacterianas

4.- Trituracin
y
agitacin con
abrasivos

Mickle
1948

Grado de desintegracin en
funcin de:
Velocidad de agitacin
Concentraci
n de las
perlas

Tamao de
las perlas

Concentraci
n de m.o.
Tiempo de
contacto

Milner 1950

5. Cizalla
lquida

Disrupcin de
cloroplastos
E. coli
glutamato
descarboxilasa

Ribi 1959
40000 psi
300 mg de
protena

Bomba de
desplazamient
o

Clulas en el
Homogeneizad
or

Vlvula
homogenzan
te

Vlvula
+
Anillo

EFECTO
DISRUPTOR
Disrupcin
de bacterias
CONTINUO

Homogeneizado
r
APV Malton
Gaulin

Paso simple,
recirculacin
discontinua

Salida
de la
suspensi
n

Ecuacin para:
# de Clulas
Vel. Del
proceso

No hay
purificaci
n
significati
va

Liberacin de
protenas

Condicion
es
determina
das

Log(Rm/RmR)=KNP^2.9

Bacterias
G(-)

Congelacin

Descongelacin

Velocidad
de
liberacin
de
protenas

Protenas
periplasmticas

AISLAMIENTO Y PURIFICACIN

Desnaturalizaci
n

Separaci
n de los
cidos
nucleico
s

CONTAMINANTES

Precipitacin

F. Cizalla
pH
F. Inica
Presencia
de
nucleasas

Tratamient
o con
nucleasas
(Preferido)
Despolimeriza
cin de los c.
nucleicos
mejora la
recuperacin
del
sobrenadante

Complejos

Centrifugacin

Bromuro
de
cetiltrime
til amonio
(Detergente
catinico)
pH, [sal],
cociente cido
nucleico/cetavl
on
pH: 5-9

Sulfato de
estreptomi
cina
Depende de
pH
Prdidas de
protena
Txico
Cepas
resistentes

Polietilenoimi
na
(Polmero
catinico)
Precipitacin de
enzimas
Inactivacin
Cancergeno

Solvent
es
orgnic
os

Concentracin por
Interaccin Protenaprecipitacin Salado de
Protena

Precipi
4C ta
0C

Desnaturalizaci
n de protenas

Metano
Acetona
Etanol
ter etlico
2-Propanol

Polmer
os de
PM

Precipitantes
orgnicos
Solubles en agua

Polietilenglicol
No se utiliza
mucho

Txico
Inflamable
Desnaturaliza protenas

Sulfato
aninico

Solubilidad
protenas
Perjudicial
Efecto
estabilizante

pH
Temperatura
Tipo de electrolito

Penicilinasa de
E.coli
20% peso/volumen
prot. no deseadas
Mejora la actividad
especfica 4 veces
56% p/v
Penicilinasa

Concentracin por
ultrafiltracin
MEMBRANA
S

Microporoso
Filtro
convencional
(Membrana
rgida, orificios
500-5000 )

Partculas de
tamao medio

Difusin
Gel hidrfilo
Solutos E.
Solventes

BLOQUEO

CRF menor
Discriminacin

Cintica
Temperatu
ra

Difusin []
molecular activid
ad

Permeabilidad

Matriz muy
hidratada
Afinidad
Polmerosolvente

Retencin:
-lactamasas de S.aureus,
B.cereus y E.coli
-N-acetilglucosaminidasa
o Ultrafiltracin en cmara
de B.sutilis

Interaccio
nes
Protena Protena
Caracterstic
as
ultrafiltracin
Variar por
factores

fra:
-5C a +5C
PERDIDAS EN
ACTIVIDAD

Mtodo
til:

Cambio de fase
Presin hidrosttica
Suave y no destructiva

Reactivos qumicos
Se consigue
CONCENTRACIN y
PURIFICACIN
Mantenimiento de F.inica
y pH evita la inactivacin
de la enzima

Concentracin por
liofilizacinDesecado en
Limitado

[sal]
Temperatura de
la masa
congelada

fro

Mezclas eutcticas (P.F. muy bajo y

constituyentes se cristalizan
simultneamente a partir del lquido.)
Desnaturalizac

in

Estudio del proceso a detalle para

cada enzima

Protenas
compuestas
por
subunidades
CATALA
SA
MIOSINA

CROMATOGRAFA EN GEL.
Reparto de las molculas de soluto
entre la fase mvil del solvente y la
fase estacionaria
FASE MVIL: Lquido que circula por
el exterior de las partculas de gel.
(Vo)
FASE ESTACIONARIA: Liquido que
ocupa el interior de las partculas en
gel (Vi)
Volumen total de la
columna:
V t = V o + Vi + Vg

Kav = Ve - Vo
Vt Vo
Donde
Ve= volumen de solvente
necesario para eluir el soluto de la
columna.
Vo= volumen vaco
Vt= Volumen total de la columna

RELACIN ENTRE EL COEFICIENTE DE PARTICIN

(Kav) y el peso molecular de las protenas
globulares

Desalado
Fraccionamiento
molecular
Cromatografa de
exclusin
Sephadex G75

CROMATOGRAFA DE INTERCAMBIO INICO

1. Resinas

Polmeros insolubles en agua que

contienen grupos catinicos (RH+) o
aninicos (ROH-)

2.
Medio
tradicional
Celulosas
3. Otros
Sephadex
geles
DEAE o CM en Sephadex G25 o
G50 (gran capacidad para
separar protenas)

Los sitios activos ms comunes en

las resinas de intercambio
CATINICO son los grupos de -SO3-H+
y los de -COO-H+

Los intecambiadores ANINICOS

contienen grupos amino cuaternario
-NH3+ CL-

CROMATOGRAFA de
afinidad b) Aquellos que

Se basa en la
interaccin ms
o menos
especfica entre
una protena y
un ligando
inmovilizado.
Incluido en uno
de estos grupos.

a) Aquellos que
sean especficos
para la protena
deseada
(anticuerpo,
sustrato anlogo
o inhibidor)

interaccionan
con varias
protenas, y que
pueden ser
especficos para
las diferentes
clases de
enzimas=
REVERSIBLE

-Celita
es una
tierra
de
diatom
eas
constitu
ida
principa
lmente
por
carbona
to de
calcio
con
algo de
silicato

Hidroxil
apatito
(HA) se
ha
usado
durante
mucho
tiempo
en
tcnica
s
disconti
nuas
para la
purifica
cin de
enzima
s

Blacta
masa
s de
B.cer
eus

Herramienta
adicional en la
purificacin de
protenas

ADSORBENTES NO
ESPECFICOS

Las enzimas se
adsorban
directamente del
cultivo a pH 7

El mtodo se
basa en la
conversin de
fosfato de calcio
secundario
(brushita) en
hidroxilapatito
por ebullicin en
medio alcalino.

Cromatografa de interaccin hidrofbica

Separa a las
protenas en
base a su
hidrofobicidad
superficial.

Utilizando
cadenas
hidrocarbonadas
de series
homlogas de
diferentes
longitudes

Las interacciones
hidrofbica son
tanto mayores
cuanto mayor
sea la fuerza
inica

La
elusin

Fuerza inica del

solvente
El pH
La composicin
Constante dielctrica

Cromatografa lquida de alta eficacia

Separa pequeas molculas
orgnicas solubles en
solventes no acuosos

La muestra a analizar es
introducida en pequeas
cantidades y sus
componentes se retrasan
diferencialmente
dependiendo de las
interacciones qumicas o
fsicas con la fase
estacionaria a medida que
adelantan por la columna.

El compuesto pasa por la

columna cromatografica a
travs de la fase
estacionaria

mediante el bombeo de
lquido a alta presin a
travs de la columna.

La alta eficacia de las

columnas de HPLC se
derivan del pequeo
tamao de sus partculas,
cuyos dimetros oscilan
entre 5 y 50 m.

TCNICAS ELECTROFORTICAS
Se denomina electroforesis a la tcnica mediante la
cual se separan las biomolecular en disolucin cuando
se ven sometidas a un campo elctrico.

Se basa en la aceleracin de partculas cargadas en un

campo elctrico , a las que se opone la friccin debida
al paso de las partculas a travs del medio que las
rodea a modo que se mueven a una velocidad
constante proporcional a su carga.

Son de alta sensibilidad, Eficacia, poder de

resolucin y versatilidad.

MTODO DE
SEPARACIN DE
PROTEINAS
* Protenas
* cidos nucleicos
* Otras biomolecular

PERMITE
DETERMINAR
* Peso molecular de una
protena
* Punto isoelctrico
* Distinguir molculas por
su carga o su forma

Separacin de
especies cargadas
( anin (-) y catin
(+))

Electroforsis

Influencia del
campo cargado
elctricamente

Movimiento al ctodo
(-) al nodo (+)

La ley de Stokes dice que las partculas esfricas de radio a, que se mueven a una velocidad V
en un medio cuya viscosidad es n, estn sujetas a una fuerza de friccin F tal que
F=6 naV

ENFOQUE ISOELCTRICO:
En capas de Sephadex o de agarosa
granulada es una idea atractiva
aunque el calor generado cuando se
usan capas de gel gruesas limita la
cantidad de protena hasta 1 g.

ELECTRODECANTACION CON
MULTIMEMBRANAS:
Puede fraccionar mezclas de protenas
tanto en procesos continuos como
discontinuos.
El mtodo consiste en la colocacin de
una protena en una clula que tiene
un cierto numero de membranas
semipermeables. Y haciendo pasar la
corriente a travs de la solucin
mediante electrodos.

Cromatoenfoque

Elucin
con
solucion
es
anftera
s

Es una forma
de enfoque
isoelctrico
realizado en un
lecho de
resinas
cambiadoras
de iones
especiales.

Separacin en dos fases acuosas

DEPENDE DE:

Puede separarse en un tanque de sedimentacin aunque se puede conseguir

una separacin mas rpida y eficaz mediante centrifugacin.

La separacin en dos fases se ha utilizado para separar y purificar a gran

pHescala pululan-6glucan hidrolasa y 1,4 alpha glucan fosforilasa a partir de
Klebsilla pneumoniae
Fuerza inica

Presencia de iones polivalentes

Localizacin exacta de la protena

APLICACIN:
aplicarse para eliminar eficazmente los restos de clulas de homogeneizados
consiguiendo un grado de purificacin.

GRACIAS