CROMATOGRAFA

EN COLUMNA

CROMATOGRAFA EN COLUMNA

La cromatografa en columna fue la tcnica

de separacin utilizada por Tswett en 1903

para separar clorofila.

CROMATOGRAFA EN COLUMNA
En este mtodo se empaca un tubo de vidrio, tal como una bureta,

con un adsorbente (fase estacionaria) como la gel de slice (slica

gel: SiO2 xH2O) finamente molida, almina ( Al2O3xH2O),
carbonato de calcio CaCO3, celulosa o florisil (Polmero de silicona
fluorada). Una cantidad de muestra de la mezcla que se desea
separar se adsorbe en la parte superior del absorbente

Separacin de los componentes de una mezcla.

ADSORBENTES Y RETENCIN
Papel
Celulosa
Almidn
Azcares
Silicato de magnesio
Sulfato de calcio
cido silcico
Gel de slice
Florisil
xido de magnesio
xido de aluminio
Almina bsica
Almina cida

Polaridad del
material adsorbente

Incrementa la capacidad de
retencin

Polaridad de los
componentes de la
mezcla

A mayor polaridad, mayor ser la

retencin y ms difcil ser mover
cada componente de la mezcla a
travs de la columna.

ADSORBENTES Y RETENCIN
Almina

A. bsica es til para separar aminas

y compuestos sensibles a la acidez.
A. cida es til para separar cidos
carboxlicos, aminocidos y
compuestos sensibles a las bases.
A. Neutra se usa para compuestos no
cidos y no bsicos, as como para
compuestos sensibles tanto a cidos
como a bases.

Gel de slice y Florisil

Se utilizan ampliamente con una

variedad de compuestos orgnicos,
incluidos los alcoholes, cetonas,
steres, compuestos azo, aminas y
cidos carboxlicos.

Celulosa, almidn y azcares

Son utiles para algunos productos

naturales muy sensibles a las
interacciones cido-base.

DISOLVENTE
En ocasiones se encuentra que un solo disolvente separa todos los

componentes de la mezcla, en otros casos, es necesario encontrar

una mezcla que pueda separarlos.
Elusin de compuestos

Hidrocarburos
Alquenos
teres
Derivados halogenos
Aromaticoas
Acetonas
Aldehidos
steres
Alcoholes
Aminas
cidos y bases fuertes

Ms rpidos (Eluirn con

disolventes poco polares)

Orden de Elucin
Ms lentos (Necesitan
disolventes polares)

 Por lo general, se comienza con un disolvente de

bajo poder eluyente para separar los compuestos

que son dbilmente retenidos por la columna,
luego aumenta de forma gradual el poder eluyente
para obligar que los componentes adsorbidos con
ms fuerza, bajen por la columna.

Formacin de fisuras

Preparacin de la columna

La preparacin correcta de la
columna de cromatografa es
crtica para su xito.

Si el adsorbente tiene fisuras,

canales o burbujas de aire, o
si tiene una superficie
irregular o fuera de la
horizontal, ser imposible
obtener una separacin
completa de la mezcla.

Preparacin de la columna
Colocar una pequea cantidad
de algodn en el fondo de la
columna.

Drenar una pequea cantidad

de disolvente y compactar el
algodn con la varilla hasta
eliminar cualquier burbija que
se haya atrapado.

Adicionar lentamente y con

agitacin la suspensin a la
columna, mantener la llave de
paso abierta y recibir el
disolvente en un matraz.

Adicionar la suspension del

adsorbente

Colocar un embudo en la parte

superior de la columna y
agregar arena formando una
capa de 1cm arriba del
algodn y se permite drenar el
disolvente.

El disolvente recuperado
deber reciclarse varias veces
por la columna para asegurar
un asentamiento completo y un
empacado firma del
absorbente a la columna.

Mtodo de la
suspensin o lechada

Sujetar con unas pinzas de

tres dedos la columna de
cromatografa en posicin
vertical.

Llenar la columna a tres

cuartas partes con elutente.

Golpear suavemente de forma

constante la columna durante
la operacin de llenado.

Aadir disolvente del matraz

colector a la suspensin en
caso de que espese
demasiado antes de ser
aadida a la columna

Preparacin de la columna
Sujetar con unas pinzas de
tres dedos la columna de
cromatografa en posicin
vertical.

Llenar la columna hasta la

mitad con eluyente

Aadir el adsorbente seco

poco a poco, mientras se
golpea la columna con
suavidad y se permite que
el eluyente fluya
lentamente.

Cuidar que el adsorbente

no se seque y que est al
nivel y sin irregularidades

Pasar el disolvente
drenado, varias veces por
la columna para asegurar
el asentamiento del
adsorbente.

El nivel de adsorbente
haya alcanzado la altura
deseada.

Mtodo de empacado en seco

Aadir una pequea capa
de arena sobre la
superficie del adsorbente.

APLICACIN DE LA MUESTRA A LA
COLUMNA

Elusin de la muestra

Monitorear el progreso
de la cromatografa

Cromatografa en columna
seca
Columna empaquetada sin disolvente
No se cambia el disolvente

Cromatografa rpida (flash)

Aplicacin de la muestra a la columna rpida (flash)

Drenar disolvente hasta 0.5
cm de la fase estacionaria.

Disolver la mezcla en la
mnima
cantidad
de
disolvente.

Colocar mezcla a separar en

la superficie de la columna.

Drenar
lentamente
el
disolvente hasta que la
muestra llegue a la superficie
del disolvente.

Elusin de la
muestra en columna
flash

Adicionar
eluyente a la
muestra gota a
gota con pipeta
pasteur,
posteriormente
con pizeta.

Abrir la llave
de la colimna
y
aplicar
presin
de
aire.

Colectar
fracciones
pequeas
(5mL a 10
mL)
en
frascos
numerados.

Ventajas y desventajas de la cromatografa en

columna
Ventajas

Desventajas

Se
pueden
purificar Toma gran cantidad de
cantidades
relativamente tiempo para establecer
pequeas de muestra.
condiciones
adecuadas
para
desarrollar
la
cromatografa cuando se
trata de sustancias nuevas.
Es
un
mtodo
de No se puede utilizar para
purificacin ms completo grandes cantidades
de
que
la
destilacin
o muestra a separar.
recristalizacin.

Teora de la eficiencia de la
columna cromatogrfica
Las columnas cromatogrficas consisten en un
nmero de zonas adyacentes en cada una de las
cuales hay suficiente espacio para que un analito est
en equilibrio entre dos fases.
Cada una de estas zonas se conoce con el
nombre de plato terico (de los que hay N en cada
columna).
La longitud de una columna contiene una altura del
plato, H, que tiene unidades de longitud, normalmente
en micras.

El valor numrico de N y H para cada columna en

particular es expresado en referencia a cada analito.
La altura del plato est relacionada con la anchura del
pico del analito y la distancia que recorre dentro de la
columna, X:

: es un estndar de desviacin de la banda

gaussiana.

Para los picos gaussianos simtricos la anchura

de la base es igual a 4 y la anchura del pico al
punto de inflexin, i es igual a 2. Por lo tanto el
valor de H puede ser calculado desde el
cromatograma midiendo la anchura del pico.

El numero de platos tericos en la columna entera viene

dado por:

Donde L es la longitud de la columna

Si consideramos la posicin del pico a X=L con el hecho

de que la anchura del pico en su base es , obtenida de
las tangentes dibujadas desde los dos puntos con ms
pendiente del pico, es igual a 4, la ecuacin anterior se
convierte en:

Si en ligar de medir L y en unidades de longitud

se hace en tuempo, la ecuacin quedar:

La medicin del ancho del pico , es ms confible

cuando se realiza a la mitad de la altura del pico, con
la cual se puede utilizar:

Tambin puede hacerse en funcin de la altura y

rea del pico:

Es importante que tanto TR, W W1/2 rea/altura se

expresen en las mismas unidades ya que N es
adimensional.

Para que un sistema sea eficiente, se necesitan

fases poco viscosas, espesores de pelicula delgados
y columnas de poco dimetro, para que se favorezca
la transferencia de masa. La velocidad promedio de
la fase mvil tambien afecta la altura del pico, por lo
que hay una velocidad ptima para obtener el
mximo de eficiencia. Generalmente se trabaja a
fluidos mayores de ste para no perder demasiado
tiempo en anlisis