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Tcnicas inmunolgicas

Tcnicas serolgicas

DIAGNSTICO POR
MTODOS
INMUNOLGICOS

Principios de Diagnstico Inmunolgico


Las enfermedades infecciosas pueden ser
diagnosticadas definitivamente solo por tres formas:
1) Demostrar la presencia en el paciente de un agente
conocido capaz de provocar la enfermedad, por observacin
directa en el material clnico obtenido del paciente o por cultivo
de laboratorio (in vivo o in vitro)
2) Deteccin de un producto especfico del agente infeccioso
(que no pueda formarse sin la presencia del agente) en el
material clnico obtenido del paciente
3) Deteccin en el suero del paciente de una
respuesta inmunolgica especfica dirigida contra el
Agente infecciosos

Caractersticas generales de la
respuesta inmune

Categoras de la respuesta inmune


Respuesta inmune mediada por clulas

o Inmunidad Celular
Respuesta inmune mediada por anticuerpos o
Inmunidad humoral

Para determinar si se ha producido un anticuerpo contra un


agente en particular, se investiga en el suero (o plasma) del
paciente la presencia de anticuerpos
El diagnstico de las enfermedades por la medicin de los
niveles de anticuerpo en suero se
denomina serologa

Caractersticas generales de la
respuesta inmune

Caractersticas de los Anticuerpos


Mecanismo determinado genticamente
Dirigidos contra un antgeno o determinante

antignico (eptope)
Los microorganismos pueden contener
numerosos determinantes antignicos
Habr por lo tanto numerosos
anticuerpos para cada antgeno
Muchos determinante antignicos
requieren ser expuestos

Caractersticas generales de la
respuesta inmune

Caractersticas de los Anticuerpos


Los anticuerpos se unen a la superficie de los

patgenos para:
Facilitar su ingestin

por las clulas


fagocticas
(Anticuerpos
opsonizantes u
opsoninas)

Caractersticas generales de la
respuesta inmune
Contribuir a su destruccin por la accin ltica

del complemento (Anticuerpos fijadores de


complemento)

Caractersticas generales de la
respuesta inmune

Caractersticas de los Anticuerpos


Aunque el ser humano produce varias

clases de anticuerpos los mtodos


serolgicos han sido desarrollados
para medir principalmente dos clases:
Inmunoglobulina M (IgM)
Inmunoglobulina G (IgG)

Solo en un caso se han desarrollado mtodos para

detectar la Inmunoglobulina A (IgA): Toxoplasmosis

Caractersticas generales de la
respuesta inmune

Caractersticas de los
Anticuerpos
IgG
Se producen mas

tardamente pero
persisten mas tiempo.
Dos imgenes
especulares, formadas
por dos protenas, con los
sitios de fijacin para el
antgeno en el extremo.
Unin mas espedfica al
antgeno (avidez)

Caractersticas generales de la
respuesta inmune

Caractersticas de los
Anticuerpos
IgM
Es el primer anticuerpo

producido en respuesta a
un antgeno (infeccin
reciente)
Cinco protenas idnticas
unidas por la cadena J
Unin al antgeno menos
avida.
No fija complemento

Caractersticas generales de la
respuesta inmune

Caractersticas generales de la
respuesta inmune

Respuesta humoral relativa frente a un


estmulo antignico

Caractersticas generales de la
respuesta inmune

Interpretacin de las pruebas serolgicas


El dogma central de la serologa es el

concepto de aumento de ttulo


Ttulo de un anticuerpo es la recproca de
la mayor dilucin de suero del paciente en la
cual an se puede detectar el anticuerpo
Pacientes con gran cantidad de anticuerpos
tendrn ttulos altos
Dos muestras de suero: perodo agudo y convalecencia. Se procesan
pareados.
Un aumento de ttulo de dos diluciones al medio (1:8 a 1:32) se
considera diagnstico de infeccin reciente (aumento de cuatro veces el
ttulo)
En la actualidad se cuentan con metodologas que permiten manejar
valores mas continuos, en ocasiones hasta en forma cuantitativa

Principios de los Mtodos Serolgicos


Reaccin Antgeno-Anticuerpo
La reaccin entre un antgeno y un anticuerpo
dirigido especficamente contra l da lugar a un
complejo antgeno anticuerpo

Utilizada ampliamente en los laboratorios para


la deteccin y cuantificacin de gran cantidad
de sustancias en diversos medios biolgicos.

Reacciones de
Aglutinacin
Cuando
el antgeno libre o unido a un soporte se enfrenta al anticuerpo,
el complejo antgeno-anticuerpo resultante se observa como una
aglutinacin
El proceso tiene dos fases: unin reversible y aglutinacin por formacin
de puentes entre los anticuerpos IgG divalentes o IgM multivalentes y los
antgenos
Los anticuerpos IgM son mas eficaces para aglutinar (Anticuerpos
completos). Los anticuerpos IgG a veces producen entrecruzamientos
(Anticuerpos
incompletos)
Se expresan como aumento
de ttulo
Dan fenmeno de prozona (aglutinacin aparente por exceso de
antgeno o anticuerpo sin aglutinacin

Reacciones de
Aglutinacin
Factores que influyen en las reacciones de
aglutinacin
Carga de las partculas
Tipo de anticuerpo
Concentracin de electrolitos
Viscosidad
Nmero de determinantes antignicos
Se emplean tanto para la deteccin de antgenos
como de anticuerpos.
Se pueden hacer de dos maneras: directas o
indirectas

Reacciones de Aglutinacin Directa


Para deteccin de antgenos
Soporte particulado con anticuerpos adsorbidos
Distintos tipos de tcnicas segn la naturaleza fsica de soporte
Aglutinacin al ltex: partculas de ltex fcilmente visibles
Deteccin en LCR de antgenos de Neisseria meningitidis,
Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae,
Streptococcus agalactiae
Hemaglutinacin pasiva: hemates como soporte
Coaglutinacin: bacterias muertas como soporte; Staphylococcus
aureus expresa la Protena A capaz de fijar el Fc de los anticuerpos

Reacciones de Aglutinacin Directa


Para deteccin de anticuerpos
Se pueden hacer en tubo, portaobjetos,
placa o pocillo de microplaca
Se enfrentan las partculas microbianas
(generalmente muertas) en suspensin
con el suero del paciente.
Si el suero del paciente posee anticuerpos frente a la bacteria, se forman
agregados visibles en el fondo del tubo o en el porta o en fondo de la
microplaca
Deteccin de anticuerpos frente a Brucella (Reaccin de Huddleson) o
Salmonella (Reaccin de Widal

Reacciones de Aglutinacin Indirecta


Para deteccin de anticuerpos
Se adsorben los antgenos en un elemento partculado (partculas de
ltex, gelatina o bentonita, o clulas como hemates humanos, ovinos
o de pavo
Se enfrentan estos elementos (antgeno + elemento particulado) al
suero del paciente.
Se observa la presencia de agregados visibles en el fondo del tubo,
porta o pocillo de microplaca
Deteccin de Treponema pallidum, Echinococcus granulosus

Pruebas de Antiglobulina
Se puede utilizar el microorganismo entero o adsorbido a un soporte
particulado.
Se enfrentan estos elementos (antgeno + elemento particulado) al suero del
paciente.
Se incuba la muestra con una anticuerpo anti-inmunoglobulina humana (antigamma)
Se observa la presencia de agregados visibles en el fondo del tubo, porta o
pocillo de microplaca.
til para detectar anticuerpos incompletos, en especial en Brucelosis.

Reacciones de Inhibicin
Basadas en la incapacidad de algunos microorganismos para realizar
determinadas actividades biolgicas en presencia de anticuerpos
especficos. Las mas utilizadas son dos:
Inhibicin de la Hemaglutinacin
Algunos virus (Rubeola, Influeza, Parainfluenza, Parotiditis, Adenovirus)
se unen a receptores de la superficie de los hemates provocando su
aglutinacin.
Esta aglutinacin puede ser inhibida por la presencia de anticuerpos
especficos en el suero del paciente
Neutralizacin
Algunos virus (poliovirus) no desarrollan su efecto citoptico habitual en
clulas de cultivo celular cuando hay presentes anticuerpos especficos.

Pruebas de Fijacin de Complemento


Se incuba suero del paciente con el antgeno. En presencia de anticuerpos
en el suero se forman complejos antgeno-anticuerpo.
Se aade una cantidad de complemento (todos los elementos).
Si inicialmente se haban formado inmunocomplejos se produce la
activacin del complemento , consumiendo todos los componentes del
sistema. Si no hay inmunocomplejos todo el sistema permanece.
Se agrega un sistema revelador constituido por hemates unidos a
anticuerpos antihemates (hemolisina)
Si hay complemento libre (ausencia de anticuerpos en la muestra) se fija a
los complejos hemate-hemolisina y los eritrocitos de lisan.
Se utiliza en laboratorios de referencia para diagnsticos de virus
respiratorios

Reacciones de
Precipitacin
Formacin de estructuras insolubles por unin ente el antgeno soluble y
el anticuerpo especfico incapaces de permanecer en solucin
El precipitado puede ser puesto de manifiesto mediante tcnicas de
nefelometra o inmunoturbidimetra, que pueden a su vez ser adaptadas a
autoanalizadores de qumica clnica o instrumentos especializados
(nefelmetros o inmunoturbidmetros)
Se pueden usar para determinar protenas reactantes de fase aguda
como PCR o demostrar infecciones previas por Streptococcus pyogenes
por AELO (neutralizacin ltica de estreptolisina O)
Tambin pueden ser observados por tincin
en placas de agarosa

Inmunodifusin doble
Tcnica de Outcherlony
Se enfrentan concentraciones conocidas de antgeno soluble con un
antisuero problema en un medio gelificado
Tras un perodo en el que se permite difundir a ambos elementos
puede observarse en el caso de que existan anticuerpos, bandas de
precipitacin que pueden ser identificadas a simple vista o mediante
tincin proteica
Se emplea en la prctica en la deteccin de anticuerpos frente a
diversos hongos productores de neumonitis por hipersensibilidad

Inmunodifusin Radial
Tcnica de Mancini
Se disuelve el anticuerpo en el agar y se colocan en pocillos
diluciones del antgeno.
Si se corre simultneamente una curva patrn puede cuantificarse
por regresin la cantidad de antgeno.
Es mas til para para la deteccin de antgenos que de anticuerpos

Contrainmunoelectroforesis
Puede ser utilizada tanto para detectar antgenos como anticuerpos
Combina la electroforesis (migracin de antgenos y anticuerpos en un
gel de agarosa por accin de un campo elctrico) con la precipitacin
(formacin de lneas de precipitado en un gel de agarosa cuando se
produce la reaccin antgeno-anticuerpo)
El antgeno de carga negativa en medio
alcalino migra hacia el anodo, es decir hacia
los pocillos del anticuerpo. Los anticuerpos
en estas mismas condiciones migran al
polo negativo o ctodo.
Se emplea en la identificacin del Arco 5
de Echinococcus granulosus

Pruebas con Anticuerpos Fluorescentes


Se utilizan anticuerpos conjugados con sustancias fluorescentes
(fluorocromos como el isotiocianato de fluoresceina o el naranja de
acridina.
Se observa la presencia o ausencia de fluorescencia observando con un
microscopio de fluorescencia
Dos variantes:
Tcnica directa (para deteccin de antgenos): se fija la muestra en un
portaobjetos con acetona, se agrega el anticuerpo marcado con el
florocromo (inmunofluerescencia directa IFD). Deteccin de
Pneumocystis carinii en esputo inducido
Tcnica indirecta (para deteccin de anticuerpos): se agrega primero el
suero del paciente sobre antgeno improntado en portaobjetos; en la
segunda fase se incuba con anticuerpo anti humano marcada con
fluorocromo (inmunofluorescencia Indirecta IFI)

Inmunohistoqumica enzimtica
Se usa el tejido del paciente, al que se le agrega anticuerpos marcados con
enzimas.
Se revela el marcador y se observa la presencia o ausencia de color.
Usado para detectar antgeno, en ocasiones post mortem, por ejemplo
pacientes infectados con Rabia

Inmunoensayos
Para detectar antgenos Metodologa ELISA
Utilizan anticuerpos de captura pegados a un elemento fijo, portaobjetos,
esfera de poliestireno, pocillo de microplaca, etc.
Se aade la muestra problema con antgeno
Se lava para eliminar otras protenas unidas en la muestra
Se agrega un segundo anticuerpo contra el antgeno, unido a un marcador
enzimtico (una enzima como la fosfatasa alcalina o la peroxidasa de rbano
picante) .
Se agrega el sustrato de la enzima, que dar un color si haba antgeno unido
Diagnstico de Chlamydia trachomatis en muestras de cuello uterino

Inmunoensayos
Para detectar anticuerpos Metodologa ELISA
Utilizan antgenos unidos a un elemento slido
(esfera de poliestireno, pocillo de microplaca al
que se le aade suero del paciente.
Si el suero tiene anticuerpos especficos se unen a os antgenos.
La reaccin se revela mediante un segundo anticuerpo conjugado con:
Enzima
Enzimoinmunoensayo (EIA)
Istopo radioactivo (I125)
Radioinmunoensayo (RIA)
Sustancia fluorescente
Fluoroinmunoanlisis (FIA)
Se lee la seal con un espectrofotmetro (EIA), contador de centelleo (RIA)
o un fluormetro (FIA)

Inmunotransferencias
Inmunobloting o Western Blot
Separacin de antgeno proteico por electroforesis en gel de poliacrilamida
Transferencia del antgeno separado a una membrana de nitrocelulosa
Se incuba la membrana con el suero del paciente y se detectan los
anticuerpos mediante una anti-inmunoglobulina humana conjugada con
una enzima.
Se forman bandas coloreadas donde se ha producido la reaccin antgeno
anticuerpo.
Se puede usar tanto para detectar antigenos como anticuerpos.
Se emplea para confirmar resultados positivos de pruebas de tamizaje por
EIA de anticuerpos frente al virus del SIDA