Validao de uma Metodologia in house de PCR em

Tempo Real para Caracterizao Molecular das Espcies

Pertencentes ao Complexo Candida parapsilosis
Alexandre de Almeida Monteiro

Introduo
Fungos tm emergido no mundo inteiro como
importantes agentes de infeces oportunistas.
Candida spp.
mortalidade substancial;
prolongado tempo de internao na UTI;

C. parapsilosis 2 espcie mais frequente

causadora de candidemia no
Brasil.

Introduo
Patgeno exgeno pele e mucosas.
Forma biofilmes em cateteres ou

outros

dispositivos implantados.
Facilmente transportado e espalhado pelas
mos colonizadas dos profissionais de sade,
por sua persistncia no
ambiente hospitalar.

http://medicinaunp.blogspot.com.br/2010_07_01_archive.html

Introduo
Duas novas espcies:
Candida parapsilosis

Candida parapsilosis

Candida metapsilosis
Candida orthopsilosis

A distribuio

destas

espcies

dentro

do

complexo C. parapsilosis em nosso meio

desconhecida.

Objetivos
Validar mtodo de diagnstico molecular in
house que permita diferenciar as espcies C.
parapsilosis, C. orthopsilosis e C. metapsilosis.
Avaliar a sensibilidade in vitro (MIC) de C.
parapsilosis, C. metapsilosis e C. ortopsilosis
equinocandina caspofungina.

Materiais e mtodos
Foram avaliados 119 casos de candidemia
causados por C. parapsilosis ocorridos no
Complexo Hospitalar da Santa Casa durante
Fev/1995 e Fev/2009.

Materiais e mtodos
Cultura e extrao:

Agar sabouraud

Meio YEPD
lquido

Extrao

Melo AS, de Almeida LP, Colombo AL, Briones MR 1998. Evolutionary distances and identification of
Candidaspecies in clinical isolates by randomly amplified polymorphic DNA (RAPD). Mycopathologia 42: 57-66.

Materiais e mtodos
qPCR Primers e sondas especficas
(molecular beacons) para cada espcie obtidas junto ao (PHRI / USA).
Fluorforos diferentes.

Materiais e mtodos

http://www.biosearchtech.com/flash/guides/formats_explained.html

Materiais e mtodos
Validao
51C

Low DNA
Mass
Ladder

CN

402

55C

53C

312

543

CN

402

312

543

CN 402

312

543

Materiais e mtodos
qPCR simplex in house
[ ] Primers; [ ] Sonda; Mg; T;
Controles positivos - fragmentos de PCR, (PHRI).
Controle negativo: H2O Milli-Q

Materiais e mtodos
O teste de suscetibilidade caspofungina foi
realizado pela tcnica de microdiluio em caldo.
Ponto de corte: MIC 2g/ml.

Materiais e mtodos
Anlise estatstica MICs:
Teste Mann-Whitney (U) SPSS 16.0.
Valor de P <0,05 foi considerado significativo.

Resultados
Dos 119 casos de candidemia avaliados, 99
foram causados por C. parapsilosis, 18 por C.
orthopsilosis e 2 por C. metapsilosis.

15% 2%

83%

C. parapsilosis
C. orthopsilosis
C. metapsilosis

Resultados
Com

relao

susceptibilidade

caspofungina, houve diferena entre as

espcies, sendo a MIC maior para C.
parapsilosis do que para C. orthopsilosis
(p=0,036).
C. parapsilosis

0,5 (0,5-1,0)

C. metapsilosis

0,75 (0,5-1,0)

C. orthopsilosis

0,5 (0,25-0,5)

Resultados
Os resultados de MIC foram semelhantes
entre C. parapsilosis e C. metapsilosis
(p=0,761).
Todos os isolados
caspofungina.

foram

sensveis

C. parapsilosis

0,5 (0,5-1,0)

C. metapsilosis

0,75 (0,5-1,0)

C. orthopsilosis

0,5 (0,25-0,5)

Concluso
Estes

dados

demonstram

que

existem

diferenas biolgicas entre as espcies e

reforam

importncia

da

adequada

especiao do complexo C. parapsilosis.

Agradecimentos
Caroline Collioni Constante
Ludmila Fiorenzano Baethgen
Sydney Hartz Alves
Luiz Carlos Severo
Alessandro Comar Pasqualotto

Public Health Research

Institute
- New Jersey (USA) -

Obrigado!
monteiro.aa@gmail.com