Produccin de protenas

recombinantes en cl eucariotas
Problemas que suelen aparecer cuando
protenas eucariticas se expresan en
cl procariotas
inestables
sin actividad biolgica
contaminantes procariticos

Sistemas de expresin eucariotas

Para eliminar los problemas de expresin
en procariotas, se han desarrollado
sistemas de expresin eucariotas
Esp. importantes para protenas teraputicas
Necesidad de que tengan idnticas
propiedades a la protena natural :
bioqumicas biofsicas funcionales

Sistemas de expresin eucariotas

Cul es la diferencia?
Modificacin post-traduccional de la mayora
de las protenas eucariotas
Cl procariotas no pueden realizar estas
modificaciones

Modificaciones posttraduccionales

Formacin de uniones disulfuro correctas

Clivaje proteoltico del precursor inactivo
Glicosilacin- agregado de residuos de azcar
Alteracin de aminocidos en la protena
fosforilacin
acetilacin
agregado de grupos sulfato
Agregado de cidos grasos

Sistemas de expresin en
levaduras: ventajas
Organismo unicelular
Bien caracterizadas gentica y fisiolgicamente
Promotores fuertes disponibles
Plsmido natural (2m)
Eucariotas, ocurren modificaciones posttransduccionales
Segregan algunas protenas
No patgeno

Vectores de levaduras
YIp: integrativos
- una copia integrada a un cromosoma

YEp: episomales
- ori 2m (alto nmero de copias)

YCp: centromricos
-ARS, CEN (1 o 2 copias por cl)
Todos tienen marcador de auxotrofia y son
shuttle

Vectores episomales
Son ampliamente usados
A menudo inestables en cultivos a gran escala
(>10L)
Estrategia - alterar las condiciones de crecimiento
para estabilizar el vector episomal
usar cepas mutantes que requieren nutrientes especficos.
Leucina, Triptofano, Histidina

el gen que provee el fenotipo salvaje se encuentra en el

plsmido episomal

Promotores de levaduras
Promoter
Acid phosphatase
Alcohol dehydrogenase I
Alcohol dehydrogenase II
Galctokinase
Metallothionein
Phosphoglycerate kinase
Triose Phosphate isomerase

Status
PHO5
ADH I
ADH II
GAL 1
Cup 1
PGK
TPI

Inducible
Constitutive
Inducible
Inducible
Inducible
Constitutive
Constitutive

Sistemas de expresin en
levaduras: desventajas
Inestabilidad de plsmidos en gran escala
Vectores episomales
Superglicosilacin de glicoprotenas
100+ residuos manosa vs. 8-13 normal
puede alterar la actividad de la protena
Protenas secretadas quedan atrapadas en
periplasma (entre la membrana y la pared
celular)
se usan seales peptdicas

Soluciones a los problemas en

sistemas de expresin en levaduras
Levaduras modificadas genticamente para
llevar a cabo glicosilacin = humanos
Science Vol 301, p1244-1246 (29 Aug
2003)
Delecin de genes de glicosilacin de
levaduras
Agregado de genes de glicosilacin humanos

Soluciones a los problemas en

sistemas de expresin en levaduras
Usar otro tipo de levaduras
Pichia pastoris
Hansenula polymorpha
No slo Saccharomyces cerevisiae

Usar otros eucariotas

Cl de insectos
Cultivos de cl de mamferos