BIOQUMICA Y NUTRICIN

Duplicacin y Transcripcin

Rivera

Dra. Elena Benavides

ADN
CONTENIDO:
-Composicin y estructura del ADN.
Organizacin gentica del ADN.
-Reacciones de replicacin del
ADN en procariotes y eucariotes.
-Fragmentos de Okasaki.
Reacciones de reparacin del ADN.
Mutaciones.

COMPONENTES DEL ADN

El ADN est
compuesto por dos
polinucletidos
enormes, cada uno
de ellos con forma de
hlice, una doble
hlice.

NUCLEOTIDO
Compuesto orgnico formado
por tres componentes: un
GRUPO
FOSFATO o radical del cido fosfrico, un
azcar y una base nitrogenada
RADICAL
DEL ACIDO
BASE NITROGENADA
FOSFORICO

citosi
na

AZUCAR (DESOXIRRIBOSA)

Las bases nitrogenadas absorben

intensamente la luz UV corta , en
la longitud de onda de 259nm
(medio importante para el dosaje
rpido de cidos nucleicos)

BASES NITROGENADAS

Las bases nitrogenadas pueden formar uniones de hidrogeno (uniones

relativamente lbiles) en algunos de sus tomos al encontrarse en la
vecindad inmediata de otro compuesto similar; este es el fundamento
de las uniones complementarias de las bases de las dos hlices.

AZUCAR (DESORRIBOSA)
Desoxirribosa (ADN)

1
3

ribosa (ARN)

1
3

Por medio del grupo

oxhidrilo se unen a dos
cidos fosfricos diferentes
en cada cadena de ADN y
determinan la polaridad

ION FOSFATO

El Ion fosfato presenta 3

valencias capaces de
combinarse. se pueden unir al
carbono 5 o 3 menos al C2 ya
que carece del grupo oxhidrilo
Los nucletidos usados en la sntesis
de ADN poseen el fosfato unido al C5
ya que el ADN se lee en sentido 5-3

En el ADN, 2 valencias de cada fosfato se unen con 2 desoxirribosas

distintas y queda una valencia libre por cada fosfato, lo que le da un
carcter fuertemente cido y su caracterstica carga negativa

ADN

El fosfato de cada nucletido convierte al ADN en un

polmero con carga negativa, es decir, un polianin. Por
ello las cargas negativas (como la de otros cidos
nucleicos) lo repelen.

En cambio las cargas positivas pueden ser de cationes

comunes como son el Na+ y el K +( monovalentes) y
mucho ms las de cationes divalentes como el Ca++ o
el Mg++ hacen precipitar los cidos nucleicos.

ESTRUCTURA DEL ADN

2,3nm

La forma B o ADN
fisiologico sigue un
trayecto de hlice
derecha, es decir, las
hlices giran en el
sentido de las agujas
del reloj.Ancho:
2,3nm , 10
nucletidos por cada
giro y 0.34 nm entre
cada par de base.

ESTRUCTURA DEL ADN

-La nica forma de unin entre las dos hlices est dada por las uniones
hidrgeno entre las bases de una y otra cadena uniones que son muy dbiles
individualmente, pero que sumadas a lo largo de un segmento, pueden unir
fuertemente las dos hlices.
-Adems, dos hlices derechas, para ser complementarias , deben caminar en
sentidos opuestos; es decir; antiparalelas, lo que se observa mejor al mirar la
posicin de las desoxirribosas en cada una de las cadenas: mientras una
avanza con el C5 la otra lo hace con el C3.

ESTRUCTURA DEL ADN

La columna vertebral de cada hlice est

formada por los iones fosfato que establecen
uniones con dos desoxirribosa contiguas
(uniones fosfodister), de manera que la ruptura
de una unin fosfodister significa cortar una de
las dos cadenas o hlices.

En el espacio, las bases nitrogenadas quedan

situadas hacia el centro de la columna formada
por la doble hlice mientras que las columnas
vertebrales de fosfatos quedan hacia fuera.

En el espacio existente entre las dos columnas

vertebrales exteriores, formadas por las uniones
fosfodister, cabe exactamente un par de bases,
una grande (purina) y una chica ( pirimidina) solo
permitir C-G, G-C, A-T, o T-A.

GENOMA PROCARIOTA

Tamao:Ejm. E. coli 4.6 Mb que

codifican alrededor de 4300
genes(1Mb=1x10 6 bases)
Capacidad codificadora son
compactos y continuos
contienen poco DNA no
codificador
Expresin gnica: Los genes
estn organizados en operones.
Un opern es un conjunto de
genes ligados que estn regulados
como una unidad. Una cuarta parte
de los genes estn organizados en
operones.
Pueden presentar pequeas
piezas de DNA plsmidos
genes no esenciales para el
desarrollo pero si para su
supervivencia

GENOMA EUCARIOTA

Tamao del genoma: mucho ms

grande que procariotas
Capacidad codificadora:
Secuencias no codificadoras
extensas Solo el 1,5% del
genoma humano codifica
proteinas.
Continuidad codificadora: La
mayora son discontinuas. Las
secuencias no codificadoras
(intrones) estn intercaladas entre
las secuencias
codificadoras(exones).
Presentan repeticiones tandem:
Son secuencias de DNA en las
que muchas copias estn
cerca unas de otras. Se
denominaron originalmente
DNA satlite varan desde 10pb
hasta 2000pb

REPLICACION DEL ADN

Replicacin es el proceso
mediante el cual el DNA
produce copias de si
mismo que garantizan la
transmisin y
conservacin de la
informacin gentica que
contiene. Tiene lugar
antes de cada divisin
celular.

Caractersticas (E.coli)

La replicacin es semiconservadora: En
cada ciclo de replicacin se mantiene
intacta una de las hebras paternas que se
combina con una de las hebras recin
sintetizadas.
Fue demostrado mediante los
experimentos realizados por M. Meselson
y Stahl en 1957

La replicacin empieza en un
punto de origen

J.Cairns y colaboradores
(1963) observaron
molculas de DNA en su
fase de replicacin
,marcada con Timina
radioactiva. Concluyeron
que en E. coli se inicia en
un lugar especfico del
cromosoma(oriC) y avanza
de manera bidireccional
El punto dinmico de la
replicacin se denomina
horquilla de replicacin

La sntesis del DNA transcurre en direccin 5 a 3

y es semidiscontinua

Las cadenas de DNA siempre

son sintetizadas en la direccin
5 3, siendo el 3OH libre el
punto de elongacin del DNA

En 1960 Okasaki descubri

que una de las hebras es
sintetizada de modo
continuo(cadena conductora) y
la otra es sintetizada de modo
discontnuo(cadena rezagada).
Los fragmentos de Okasaki
tienen una longitud variable
entre cientos a millares de
nucletidos.

Polimerasas mltiples en las

clulas

DNA polimerasa I: Caracterizada por

Korn-berg(1955)No es la enzima que
replica la mayor parte del DNA en E.
coli. Juega un papel crtico en la
replicacin y reparacin del DNA.
Tiene actividad exonuclesica 5 3 y
3 5

DNA POLIMERASAS
-Las DNA polimerasas son las responsables
de la sntesis del DNA.
-Catalizan la adicin de un desoxinucletido
trifosfato (dNTP) complementario al
extremo 3'OH de una cadena
polinucleotdica.

DNA POLIMERASAS

Todas la DNA polimerasas requieren para

su actividad lo siguiente:
Una hebra de DNA que sirva de molde.
Una cadena cebadora o primer con un
extremo 3'OH libre.
Los 4 desoxiribonucletidos trifosfatos.
Mg++

Se requiere de un cebador

El cebador es una cadena preformada a cuyo extremo 3

se adicionen dNTPs.
El cebador es un corto segmento de RNA

Enzimas y protenas accesorias

DNA helicasa, se mueve a lo largo del DNA

separando las hebras . Usa ATP.
DNA girasa, libera el stress topolgico de la
estructura del DNA, hace cortes en las 2 hebras
del DNA y produce la rotacin de las hebras del
DNA.
Primasa, Sintetiza los cebadores o primers, los
cuales son segmentos cortos de RNA.
Protenas SSB , (Single Strand Binding)
protenas que se unen a una cadena simple de
DNA , mantienen las hebras separadas .

Helicasas

Separan las hebras del DNA al

frente de la horquilla replicativa en
movimiento.

En E. coli se han usado los nombres

de helicasa II y protena rep.

Topoisomerasas
Cambian el estado de superenrrollamiento
del DNA. Las mejores estudiadas son:

DNA girasa que induce la formacin de

sper enrollamientos negativos a
expensas del ATP

Topoisomerasas del tipo I tienden a

producir relajamiento del DNA
superenrrollado

Protenas fijadoras

Las proteinas de fijacin a hebras

sencillas(ss binding) no consumen
ATP y no presentan actividad
enzimtica.

Su papel es mantener las hebras

separadas el tiempo suficiente y
protegerlas del ataque de las
nucleasas.

Sintesis del DNA en procariotas

1.-INICIACIN
Desenrrollamiento del DNA: Se abre la hlice
del DNA y establece el complejo precebador.
La proteina dnaA se une en la regin de
repeticiones de 9 pb en el origen y desnaturaliza
la regin de repeticin de 13pb. Requiere ATP y
proteina HU.
Proteina dnaB (helicasa) en presencia de dnaC
desenrrollan el DNA dplex.

ETAPAS DE LA REPLICACION

La sntesis de una molcula de DNA puede

dividirse en 3 etapas: iniciacin , elongacin y
terminacin. Cada una de ellas se diferencia por
las reacciones y enzimas que intervienen.

En general cualquier reaccin de polimerizacin

puede dividirse en 3 etapas que tambin
ocurren durante la sntesis del RNA y sntesis de
protenas.

INICIACION

La iniciacin de la sntesis del DNA en E. coli

empieza en oriC , que es el origen de la
replicacin cromosmica.
OriC , es una regin del cromosoma de 245
pares de bases (pb), que tiene 2 conjuntos de
secuencias conservadas .
3 repeticiones en tamden de una secuencia de
13 pb en un extremo del origen.
4 copias de una secuencia de 9 pb distribuidas
en orientaciones invertidas en el otro extremo
del origen.

Iniciacin en E. coli

El complejo de DnaA denatura las

repeticiones de 13 pb y forma un
"complejo abierto" de 45 bp. Esta reaccin
tambin requiere ATP.

Iniciacin en E. coli

Un complejo formado por las protenas DnaB y

DnaC se une a la regin denaturada para formar
un "complejo precebador" o "complejo
prepriming" . La protena DnaB es una helicasa
que desenrolla el DNA bidireccionalmente y crea
dos horquilla de replicacin potenciales.
En presencia de las protenas SSB y la DNA
girasa, La DnaB desenrrolla an mas el DNA.
Esto permite la entrada de la primasa ( producto
del gen DnaG).

PRIMOSOMA
La iniciacin de la replicacin requiere
de un complejo que se conoce como
primosoma , compuesto de la protena
helicasa o DnaB y de la primasa o
DnaG.
Sus funciones son:
Separar las hebras en la horquilla de
replicacin
Catalizar la sntesis de los cebadores.

2.Sntesis del cebador

La formacin de segmentos cortos de

RNA que se denominan cebadores,
necesarios para la iniciacin de la
replicacin del DNA est catalizada
por la primasa, una RNA polimerasa
Se denomina primosoma a un complejo
multienzimtico que contiene primasa
y varias proteinas auxiliares

ELONGACION

Es un proceso en el cual participan

muchas protenas
La cadena lider (leading) es
sintetizada en forma continua en
direccin 5'->3
La cadena retrasada (lagging) es
sintetizada en direccin 5'->3 pero
en forma discontinua.

ELONGACION

RNA primers o cebadores, son

segmentos de RNA de 1 a 60 nt
complementarios a una cadena
patrn de DNA.
En E. Coli son sintetizados por la
RNA polimerasa y por la primasa.

Sntesis de la hebra gua

La sntesis de esta hebra se realiza

en forma continua. El RNA cebador
o RNA primer es sintetizado por la
primasa y luego la DNA polimerasa
III sintetiza el DNA procesivamente
hasta el final.

Sntesis de la hebra
retrasada

La sntesis de esta hebra se realiza en forma

discontinua y en direccin opuesta al
movimiento de la horquilla de replicacin
Se sintetiza usando fragmentos cortos,
llamados fragmentos de Okazaki, los cuales son
unidos a aquellos que fueron sintetizados
previamente.
Los RNA cebadores con el que empieza cada
fragmento de Okazaki tiene que ser retirado

3.-Sntesis de DNA

La holoenzima polimerasa III es la principal

enzima que sintetiza DNA en los procariotas
Est formada por al menos 10 subunidades.
La polimerasa central est formada por tres
subunidades: alfa, psilon y theta.
La proteina beta forma un anillo alrededor
de la cadena molde de DNA.
El complejo gamma formado por cinco
subunidades reconoce las cadenas sencillas
de DNA con cebadores y transfiere la
proteina beta a la polimerasa central

Modelo del Replisoma

La hebra gua se asocia al complejo de

manera directa.
La hebra retrasada se asocia al complejo
envolvindose alrededor de este.
De esta manera, tanto las hebra gua como la
hebra retrasada pueden replicarse al mismo
tiempo por intermedio de un complejo de
protenas que se mueven en una sola
direccin

Modelo del Replisoma

El modelo del Replisoma, tiene como finalidad

tratar de explicar los movimientos contradictorios
que ocurren durante la sntesis del DNA.
En este modelo todas las protenas que deben
estar presentes en la horquilla de replicacin
forman un complejo grande. Sin embargo, la
manera como las 2 hebras que estn siendo
replicadas se asocian con el complejo es
distinto.

Replisoma
La mquina de replicacin del DNA que se
denomina replisoma est formado por dos copiasde
la pol III, el primosoma y las proteinas de
desenrollamiento del DNA.
La hebra gua o conductora se sintetiza de forma
continua. La hebra retrazada se sintetiza en
fragmentos de modo que la polimerizacin
5 3 conduce al crecimiento global en el sentido 3
5.

Esto se puede lograr por la formacin de un

bucle del molde para la hebra retrazada
El molde de la hebra retrazada pasara
entonces a travs del centro polimerizador de
una subunidad de una polimerasa III dimrica,
en el mismo sentido que el molde de la hebra
gua en la otra subunidad
La DNA polimerasa III abandona el molde de la
hebra retrazada despus de que se ha aadido
1000 nucletidos a esta hebra. Entonces se
formara un nuevo bucle.

Unin de fragmentos de DNA

Cuando se completa la replicacin ,las

brechas entre los fragmentos de la hebra
retrazada se rellenan por la actividad de la
DNA polimerasa I que tambin utiliza su
actividad exonuclesica para eliminar el
cebador ribonucleotdico.
Finalmente la DNA ligasa enlaza estos
fragmentos de DNA

Terminacin

Las secuencias ter se encuentran dispuestas en

el cromosoma en dos grupos con orientacin
opuesta
Los cromosomas recin completados quedan
encadenados, es decir ligados topolgicamente
En E. coli la topoisomerasa IV corta
transitoriamente las dos hebras de uno de los
cromosomas , permitiendo que el otro
cromosoma pase a travs de la rotura.

REPLICACION EN EUCARIONTES

La replicacin en eucariontes es un
proceso mucho ms complejo que la
replicacin en bacterias
El DNA de eucariontes es mucho ms
grande y est organizado formando una
estructura nucleoproteica compleja como
es la cromatina.

DNA POLIMERASAS DE EUCARIONTES

Los eucariontes tienen 5 DNA polimerasas dos

de las cuales (alfa y delta) son importantes para
la replicacin de los cromosomas eucariticos

La velocidad de sntesis del DNA en las clulas

eucariticas es solo 50 nucletidos por
segundo, cerca de un dcimo de la velocidad de
la sntesis del DNA bacteriano.

REPLICACION EN EUCARIONTES

Los cromosomas de eucariontes tienen

mltiples orgenes de replicacin.

En la levadura se les conoce como

secuencia de replicacin autnoma o
ARS . La levadura tiene aproximadamente
400 elementos ARS en 12 cromosomas.

Replicacin eucaritica

Los ndices de desplazamiento de la horquilla no

exceden los 30000 pb por minuto, velocidad
considerablemente menor que en E. coli

Sin embargo el ciclo replicatorio se completa en

horas gracias a factores de compensacin :

1.Las clulas eucariticas contienen un gran nmero

de molculas de DNA polimerasa (superior a
20000 en comparacin a las dos docenas de
molculas encontradas en E.coli.

Replicacin eucaritica
2. Las molculas de DNA polimerasa inician la
sntesis bidireccional no en uno sino en varios
puntos de iniciacin a lo largo del cromosoma
Los segmentos situados entre dos puntos de
iniciacin se denominan replicones . Por lo tanto
para una molcula que tiene 1000 replicones se
puede producir la replicacin de ,manera
simultnea en un mximo de 2000 horquillas

La expresin de la
informacin gentica
contenida en un segmento
de DNA siempre requiere la
sntesis de una molcula de
RNA.

Durante el proceso de
transcripcin , una
enzima, llamada RNA
polimerasa, convierte la
informacin gentica de
un segmento de DNA en
una hebra de RNA con
una secuencia
complementaria a una de
las hebras del DNA.

Formas de la RNA polimerasa

La enzima ncleo, compuesta de 2 subunidades alfa,

una subunidad beta y una subunidad beta prima. Es
capaz de copiar ambas hebras del DNA pero carece de
especificidad.

La RNA polimerasa holoenzima, es la forma

totalmente funcional de la enzima. Consiste de la
enzima ncleo ms el factor sigma. Tiene especificidad
y reconoce seales especficas de inicio de transcripcin
en el DNA conocidas como regiones promotoras,
debido a la presencia del subunidad o factor sigma que
reconoce las regiones promotoras y que luego de la
iniciacin se disocia.

Requerimientos de la RNA
polimerasa

Para su actividad la RNA polimerasa

requiere:
Un DNA molde
Mg ++ o Mn++
Los cuatro ribonuclesidos trifosfatos
(ATP, GTP, UTP, CTP)

El molde es el DNA

El RNA es sintetisado de 5 a 3

Mecanismo general de la
transcipcion

La RNA polimerasa requiere un DNA de

doble cadena como molde. Sin embargo

durante la transcripcin de un gen en particular,
slo una de las hebras del DNA llamada hebra
anti-sentido o hebra molde (antisense
strand) , es copiada a RNA. La hebra de DNA
complementaria a la molde se le llama hebra
con-sentido (sense strand).

PROMOTORES

La sntesis del RNA se inicia en un

promotor

Un promotor es una secuencia de DNA a

la cual la RNA polimerasa se une, para
posteriormente iniciar la transcripcin.

Secuencias de consenso

Reveladas por la comparacin de las

secuencias de muchos promotores
bacterianos.

Estn localizadas aproximadamente 10 y

35 pares de bases cuesta arriba del
punto de iniciacin

Secuencias de consenso

Exhiben homologa.

La secuencia de consenso -10 es: TATAAT (caja

TATA).

La secuencia de consenso -35 es: TTGACA

Ambas hebras codifican

genes

Pasos de la Transcripcin

La RNA polimerasa se desliza a travs del

DNA buscando promotores.

Cuando encuentra un promotor migra a la

regin -35, formando lo que se conoce
como "complejo cerrado".

Pasos II

Luego el DNA es desenrollado en

aproximadamente 17 pares de bases formando
un "complejo abierto" que empieza en la
regin -10, y que descubre la hebra molde en el
sitio de iniciacin.
Despus de la iniciacin la subunidad sigma se
disocia de la RNA polimerasa y la enzima
ncleo con el proceso de elongacin de la
transcripcin.

Elongacin

Subunidad sigma se separa.

El RNA sintetizado forma un hbrido
transitorio de 12 bp. con el DNA.
50 nucletidos por seg.
El DNA se enrolla detrs de la RNA
polimerasa y se desenrolla delante de ella.
No hay prueba de lectura.

Terminacin

1.
Terminacin independiente de factor,
que consiste en una secuencia de nucleotidos
que permite la formacin de una regin
apareada con forma de alfiler en el mRNA
seguida de un tramo de residuos de uracilo (U).
1.
Terminacin dependiente de factor,
requiere de un factor proteico. El sitio de
terminacin llamado rut (el nombre viene de rho
utilization) , es reconocido por un factor
especfico llamado rho.

Transcripcin en eucariontes

Esta compartamentalizada debido a

la presencia de la envoltura nuclear.

El RNA naciente de eucariontes es

procesado para formar el RNA
maduro.

Transcripcin en Eucariontes

Los eucariontes tienen 3 tipos de RNA

polimerasa.

Todas nucleares.

La alfa-amanitina ,es una toxina extrada

de un hongo, se une a la RNA polimersa e
inhibe la elongacin

RNA Polimerasa II

Ms compleja que la RNA pol de E. Coli.

Consiste de 10 polipptidos (10 220 kD).
RPB1, RPB2 y RPB3 son esenciales
equivalen a las subunidades beta, beta
prima y alfa respectivamente.
RPB4 a la subunidad sigma
RPB5, RPB6 y RPB8 son componentes
esenciales de las 3 RNA polimerasas de
eucariontes.

Promotores de
Eucariontes

Tienen una caja TATA cerca al sitio de

inicio.
Otros elementos adicionales de control
estn localizados entre -40 y 110.
Los promotores fuertes tienen:
- caja CG
- caja CAAT

Promotores: Procariontes Vs
Eucariontes

Transcripcin Eucariontes

Maduracin Postranscripcin.

El producto inmediato de la transcripcin es una

molcula de RNA precursora, el transcrito primario,
que se modifica posteriormente dando una molcula
funcional madura.

La suma de las reacciones enzimticas que

conducen a las molculas de RNA funcionales
maduras se denomina: tratamiento, maduracin o
elaboracin de RNA-protena.

Estn implicados procesos como : modificaciones de

bases, modificaciones de azcares, formacin de
hlices, formacin de complejos RNA protena, etc.