PRACTICA N1 EQUIPOS DE

LABORATORIO EN MICROBIOLOGA.
PREPARACIN DE MATERIAL PARA
MICROBIOLOGA
DOCENTE: QUISPE MANCO; MARIA DEL CARMEN
INTEGRANTES:
ARIAS GUZMAN; EVELYN
CHAVEZ QUIJANO; MELISSA
FERNNDEZ ROCCA, CARLOS
HURTADO QUISPE; MELINA
PALPA GOMEZ; JESICA
TRUJILLO MUCHA; MILAGROS

ESTERILIZACIN DE PLACAS
Y TUBOS
POR CALOR SECO (180C POR 1
HORA)
Los microorganismos se destruyen
por oxidacin para eso se necesita
que la temperatura y el tiempo sea
mayor para que actu sobre los
microorganismos. El calor se inicia
por conduccin y se propaga por
conveccin.
Ejemplo: materiales de vidrio.

ESTERILIZACIN DE MEDIOS
DE CULTIVO
POR CALOR HMEDO:
POR 15 MINUTOS)

(121C

El
mecanismo
de
accin
del
funcionamiento del autoclave se
funde en ebullicin del agua a una
presin superior a lo normal y al subir
la presin atmosfrica aumenta la
temperatura. En consecuencia si la
presin del vapor aumenta, la
temperatura tambin sube y as el
vapor penetra por osmosis a la clula
coagulando su citoplasma.

ESTERILIZACIN DE MEDIO
ORGNICO
TINDALIZACIN
Consiste en someter el
producto 3 das sucesivos a
un calentamiento entre 56100c, logrando destruir las
formas vegetativas, sirve
para esterilizar sustancias
orgnicas. Su objetivo es
destruir las esporas cuando
estas germinan evitando
contaminaciones por
microorganismo
resistentes.

ESTERILIZACIN DE MEDIO
ORGNICO
FILTRACIN
El
mecanismo
de
filtracin se debe al
hecho
de
que
los
microorganismos
por
tener carga negativa y
los
filtros
positiva,
quedan absorbidas al
actuar la presin o
vaco.

PREPARACIN DE MEDIO DE
CULTIVO
A. AGAR MAC CONKEY
B. AGAR MANITOL
C. AGAR SANGRE
Se puso en bao maria
por 15-20 minutos hasta
que el medio se ponga
transparente. Luego se
deja enfriar hasta 45c y
se vierte a las placas
(100 mm) aprox. 30 ml. A
agar base se le agrega
5% de sangre de carnero
(pero en este caso se
utilizo sangre humana).

A
B

PREPARACIN DEL MEDIOS

DIFERENCIALES
A.

CITRATO

B.

LIA

C.

UREA

Se puso en bao mara por

15-20 minutos hasta que el
medio
se
ponga
transparente. Luego se deja
enfriar hasta 45c y se
vierte a los tubos. En el
caso de lia es tubo debe
tener fondo y pico (para que
la bacteria se desarrolle en
medio anaerobio y aerobio),
en el caso de urea y citrato
debe tener pico de flauta.
Estos medios se utilizan
para la identificacin de
bacterias GRAM (-)

C
B

CUESTIONARIO 1
1. Qu es la bioseguridad, de cuntos niveles consta y qu
caractersticas posee cada uno de estos niveles? Qu tipo de
laboratorio realizamos las practicas de la universidad?
La bioseguridad es un conjunto de medidas probadamente eficaces
para evitar la adquisicin accidental de infecciones con patgenos
contenidos en las muestras, as como los riesgos relacionados con la
exposicin a agentes qumicos, fsicos o mecnicos a los que est
expuesto el personal en los laboratorios.
Nivel de
Biosegur
idad

Riesgo
Biolgico

Mnimo

Tipo de Laboratorio

Estudio y Agentes

Enseanza bsica
investigacin

Estudio de infecciones de bajo

riesgo. Agentes: neumococos,
salmonella

Moderado

Servicios de atencin
primaria; diagnostico,
investigacin

Agentes infecciosos: hepatitis, la

enfermedad de lyme, influenza.

Alto

Diagnostico especial,
investigacin

Se requiere mltiples vacunas.

Agentes infecciosos: ntrax, tifu ,
VIH

Extremo

Unidades de patgenos
peligros

Agentes infecciosos: ebola,

hantavirus

CUESTIONARIO 1
2. Realice un cuadro resumen con los mtodos fsicos y qumicos
de esterilizacin?

Esterilizacin

Fsico

Calor

Qumico

Radiacin

Gases
Oxido de
etileno

Seco

Poupinel

Hmedo

Vapor a
presin

Ionizantes
Radiacin
gamma

Perxido de
hidrogeno

Formol

CUESTIONARIO 1
3. Cul es la ventaja del
uso del autoclave?
La ventaja que posee este
mtodo de esterilizacin es
que el tiempo de exposicin
de los materiales a estilizar es
mas corto que el calor seco,
reduce
el
tiempo
de
exposicin
para
la
esterilizacin por que reduce
el tiempo de ciclo completo,
no deja residuos txicos en
material, DESTRUCCN DE
BACTERIAS Y ESPORAS EN
CORTO TIEMPO y hay bajo
deterioro
del
material
expuesto.

CUESTIONARIO 1
4. Cmo realiza el control de calidad en calor seco y
hmedo?
CALOR SECO: Se realiza control de calidad con Cintas Testigo,
Controles qumicos internos, Color test,
CALOR HUMEDO: Se realiza control de calidad con Cintas Testigo,
Bowie & Dick,

CUESTIONARIO 1
5. Mencione los pasos a seguir
cuando
un
cultivo
lquido
bacteriano se derrama sobre una
superficie.
Primero se le agrega un desinfectante
para este tipos de caso seria un
betagen (desinfectante cuaternario) o
leja estos inactivaran a la bacteria,
luego se procede a cubrir con un pao
y se avisa que tipo de bacteria se cayo
en la zona, finalmente se avisa al
personal de limpieza que estn
altamente
capacitados
ellos
terminaran de limpiar la zona,
llevndose el material contaminado
para ponerlo en una bolsa roja y
autoclavarlo.

CUESTIONARIO 1
6. Cules son los riesgos y problemticas en el grupo que se
tendrn al no seguir las indicaciones recomendadas?
RIESGOS
Que se puedan sufrir accidentes en la prcticas de laboratorio.
Que exista el riesgo de contaminacin por los medios de cultivos que se
usan y/o materiales potencialmente contaminantes.
Que se sufra contaminacin en el lugar del trabajo
PROBLEMTICA
Que no se sepa como actuar en caso de un accidente
Que se pueda ensuciar la mesa de trabajo por no seguir reglas o
cuidados de como manipular materiales potencialmente peligrosos.

PRCTICA N2
COLORACIONES
SIMPLES Y
COMPUESTAS

COLORACIONES SIMPLES Y
COMPUESTAS
TINCIN SIMPLE
Se utiliza para determinar la morfologa
bacteriana y la agregacin o tipo de
distribucin bacteriana. Se caracteriza
porque:
Necesita fijacin previa
Se utiliza un solo colorante
Se basa en la afinidad de los colorantes a
los distintos componentes celulares, ya
que las clulas bacterianas en medias a
pH neutros suelen presentar una dbil
carga negativa. As pues la bacteria
cargada negativamente se combinara con
los iones positivos de los colorantes
bsicos (azul de metileno), de tal forma
que la bacteria quedara coloreada.

TINCIN DIFERENCIAL
TINCIN GRAM
Se utiliza para diferenciar bacterias GRAM (-) y GRAM (+), esta diferenciacin se
debe a la pared celular de la bacteria.
Se necesitara fijacin previa generalmente por calor.
Se basa en el empleo de un primer colorantes bsico (cristal violeta) la cual teir a
las bacterias de azul; posteriormente un mordiente (lugol) la cual aumentara la
afinidad del primer colorante a las clulas. Finalmente un agente decolorante que
decolorar solamente un tipo de bacterias que sern teidas con el colorante de
contraste.

Este distinto comportamiento frente a la decoloracin es dependiente de la

composicin de la pared bacteriana, hecho que servir para clasificarlas como GRAM
+ (aquellas que no han sido decoloradas y que por lo tanto quedan teidas de azul)
o como GRAM (aquellas bacterias que han sido decoloradas y son teidas de color
rojo).
Para esta coloracin se utilizaros las cepas 10 (BGP) y la 11 (VC)

TINCIN DIFERENCIAL

Cepas 10 y 11

Cristal
violeta x
1 min.

Recoleccin de
las cepas

Lugol
alcohlic
o por 1
min.

Alcohol
acetona
para
decolorar
por 30
seg.

Combinar
solucin salina
con cepas

Safranina
por 30
seg.

TINCIN DIFERENCIAL
TINCIN ZIEHL- NEELSEN
Se utiliza para bacterias alcohol acido resistentes (Mycobacterium)
esto se debe al alto contenido lipdico de estas bacterias,
fundamentalmente fosfolpidos ceras y cidos micolicos.
La fucsina fenicada, resiste la decoloracin porque esta muy ligado
a los lpidos ya que es ms soluble en ellos que en el agente
decolorante.
De ah que se necesiten, para este tipo de tinciones, colorantes
altamente concentrados as como la presencia de calor que facilite
su penetracin al interior de dichas bacterias han quedado teidas,
su decoloracin posterior no es posible, resistiendo incluso a
decoloraciones acidas. As pues, utilizando esta propiedad
podemos diferenciar este tipo de bacterias, como es el caso del
genero Mycobacterium, del resto que no presentan esta propiedad.
El azul de metileno se utiliza como colorante de contraste

TINCIN DIFERENCIAL

Yogurt

Fucsina
Fenificada por 5
min.

Decolorar con
alcohol cido

Emisin de los 3
vapores

Azul de metileno
por 2 min.

COLORACIN ESTRUCTURAL
TINTA CHINA
Se utiliza para observar las capsulas de las bacterias.
No son una verdadera tincin. se llaman as porque lo que
realmente se tie es el fondo sobre el que estn los
microorganismos apareciendo los microorganismos sin teir. se
emplea para ver la cpsula des. pneumoniaeyCryptococcus
neoformansen LCR.

COLORACIN PARA ESPORAS

TCNICA
CONKLIN

DE

WIRTZ

Se
utiliza
para
la
identificacin de esporas las
cuales se observaran de
color verde (debido a su
tincin
con
verde
de
malaquita)
entre
las
bacterias que presentaran un
color rojo (debido a su tincin
con safranina).
Verde de malaquita 2 por 3
min.
Calentar con el mechero
hasta
la
emisin
de
vapores.
Aplicar la solucin
safranina por 1 min.

de

CUESTIONARIO 2
1.Cul es la diferencia entre bacterias gram positivas y gram
negativas, cul es el fundamento de la coloracin gram?
Es probable que la diferencia entre las bacterias gram positivas y gram
negativos se deba a la naturaleza fsica de sus paredes celulares
Gram positivas: las bacterias gram positivas poseen una capa gruesa de
peptidoglicano y carecen de membrana externa
Gram negativas: el peptidoglucano es solo una pequea porcin de la
pared, en la que predominan las protenas, fosfolpidos, y lipopolisacaridos
que se unen formando tres capas. la capa externa formada
lipopolisacaridos, fosfolpidos y protenas. la capa intermedia es mas fina
integrada por molculas de lipoprotenas. la zona mas profunda de
peptidoglucano.

CUESTIONARIO 2
Fundamento
Durante el proceso de coloracin las bacterias se tien primero
con cristal violeta en mezcla con el lugol forma en la clula el
complejo carbohidrato -protena- ribonucleato de magnesio que
al ser tratado con alcohol acetona no cede a la decoloracin,
quedando teida de violeta. En cambio las que se decoloran se
tienen con el colorante de contraste safranina. Dicho
comportamiento se debe a la diferencia a la pared celular de los
dos tipos de clulas.
2. Qu es un mordiente para qu se utiliza?
Los mordientes, aunque no son colorantes, tienen gran
importancia en algunas tcnicas de tincin. Los mordientes
intensifican la tincin porque aumentan la afinidad de la clula
por el colorante. Tambin se pueden utilizar para producir un
engrosamiento de ciertas estructuras celulares externas, como
los flagelos, que debido a su delgadez no podran ser visualizados

CUESTIONARIO 2
3. Cmo realizara el control de calidad de las tinciones?
Para un control optimo por ejemplo en este caso de la tincin
Gram, los organismos empleados podran incluir un organismo
Gram positivo que tienda a decolorarse rpidamente, tal como un
Bacillus sp. y un organismo Gram negativo, tal como Neisseria
catarrhalis. los porta control pueden emplearse para controlar los
reactivos nuevos o auxiliares de laboratorio que teirn los portas.
los porta control deben teirse por lo menos una vez a la semana y
cada vez que se prepara un reactivo nuevo. Los resultados deben
anotarse en el libro de control de calidad apropiado. para estar
seguros de que los portas control se examinan y realmente con
cuidado, los tipos o proporciones de bacterias Gram-positivo y
Gram-negativo pueden cambiarse peridicamente.

CUESTIONARIO 2
4. Mencione ejemplos de tinciones estructurales
Para la capsula
Colorante de his
Colorante de anthony . welch
Colorante de nigrosina
Para flagelos
Colorante de leifsson
Colorante de casares
Para grnulos o corpsculos de inclusin
Colorante de loeffler para corinebacterum
Colorante de Albert

PRCTICA N3
PREPARACIN DE
MEDIOS DE CULTIVO

POR SUS CONSISTENCIA MEDIOS LQUIDOS O CALDOS

Usualmente se denominan caldos
ya que contienen los nutrientes
disueltos en agua. Permiten
obtener suspensiones con un
elevado nmero de
microorganismos. Ej. Caldo
nutritivo.
Si la bacteria crece en un medio
lquido, en la mayora de los casos
las clulas que se producen en
cada divisin continan su vida
independientemente formndose
una suspensin de clulas libres.

POR SU CONSISTENCIA MEDIOS SLIDOS

Se pueden preparar a partir de medios lquidos a
los cuales se les aaden agentes solidificantes
como agar, gelatina o slica gel. Se utilizan con
frecuencia en el aislamiento y mantenimiento de
los microorganismos en el laboratorio. Ej. Agar
nutritivo.
La cintica de crecimiento, en este caso, se
puede estudiar siguiendo la evolucin del
nmero de clulas viables por unidad de
superficie o por unidad de masa.
Cuando una clula aislada e inmvil comienza a
crecer sobre un substrato slido, el resultado del
crecimiento al cabo del tiempo es una colonia.
Por consiguiente, se denomina UNIDAD
FORMADORA DE COLONIA (UFC) a una clula
bacteriana viva y aislada que si se encuentra en
condiciones de substrato y ambientales
adecuadas da lugar a la produccin de una
colonia en un breve lapso de tiempo.

POR SUS CONSISTENCIA MEDIOS SEMISLIDOS

Se preparan a partir de los

medios lquidos, agregando a
stos un agente solidificante
en una proporcin menor que
para preparar medios slidos.
Uno De sus usos es la
investigacin de la movilidad
de las bacterias.

POR SU COMPOSICIN MEDIOS COMPLEJOS

Fueron los primeros utilizados, y
los ms empleados. Estn
constituidos por sustancias
complejas de origen animal o
vegetal y usualmente se
complementan con el aadido de
minerales y otras sustancias. No
se conocen todos los
componentes del medio de
cultivo, ni las cantidades exactas
en que estn presentes. Ej.
Extracto de carne, extracto de
levaduras.

POR SU COMPOSICIN
MEDIOS DEFINIDOS
Son aquellos que contienen en
su composicin
exclusivamente sustancias
qumicas conocidas y disueltas
en agua destilada en
proporciones determinadas,
resultando un medio de
composicin perfectamente
definida. Por su costo slo se
emplean en procedimientos
especiales.

POR SU UTILIZACIN
MEDIOS SELECTIVOS
Son medios utilizados para
favorecer el crecimiento de
ciertas bacterias una
poblacin polimicrobiana. El
fundamento de estos
medios consiste en facilitar
nutricionalmente de una
poblacin microbiana
especfica. Un ejemplo de
medio selectivo es el caldo
selenito, que favorecer el
crecimiento de salmonellas
y frenar el del resto de
enterobacterias
Ej. Agar desoxicolato citrato
utilizado para el aislamiento
de patgenos entricos.

POR SU UTILIZACIN
MEDIOS DIFERENCIALES
Se utilizan para poner en evidencia
caractersticas bioqumicas
diferenciar gneros o especies. No
contienen sustancias inhibidoras, es
decir, permiten el crecimiento de
muchos tipos de microorganismos,
pero si contienen indicadores de
productos derivados de la actividad
metablica de los microorganismos
sobre algunos de los componentes
del medio. Se utilizan para la
identificacin de los
microorganismos.
Ej.: Agar base rojo fenol utilizado
para detectar fermentacin de
carbohidratos.

CUESTIONARIO N3
1. Cules son las recomendaciones para preparar agar sangre y agar chocolate?
PARA ELLO ANTES DE COMENZAR EL TRABAJO SE ESTERILIZAR, JUNTO CON LOS MEDIOS DE
CULTIVO, EL MATERIAL QUE POSTERIORMENTE VA A SER UTILIZADO.
AGAR SANGRE:
CALENTAR CON AGITACIN FRECUENTE
ESTERILIZAR 20 MINUTOS A 121C.
ENFRIAR A 45-50C AGREGAR 5-10 % DE SANGRE OVINA DESFIBRINADA ESTRIL A
TEMPERATURA AMBIENTE AL MEDIO ESTERILIZADO, FUNDIDO Y ENFRIADO A 45-50 C.
HOMOGENIZAR DE FORMA MUY SUAVE Y DISTRIBUIR EN PLACAS DE PETRI ESTRILES SIN
GENERAR BURBUJAS CERCA AL MECHERO. EL MEDIO LISTO PARA USAR SE GUARDA A
TEMPERATURA DE 2 8C.
AGAR CHOCOLATE:
DESPUS DE AADIR LA SANGRE Y AGITANDO FRECUENTEMENTE SE MANTIENE EL MEDIO
DE CULTIVO A 80C POR 10 MINUTOS HASTA QUE ADQUIERA UN COLOR PARDO
CHOCOLATADO.
TENER EN CUENTA LAS CONDICIONES DE ESTERILIDAD, BIOSEGURIDAD Y TEMPERATURA.

CUESTIONARIO N3
2. Realizar un cuadro de 10 medios de cultivo: tipo de medio, PH
e indicador

CUESTIONARIO N3
3. Cmo se realiza el control de calidad de los medios de cultivo?
Control de calidad del agua destilada.
Conductividad.
Ph
Contaminacin microbiana
Libre de sustancias bactericidas, inhibidoras o interferentes
Se debe llevar un registro actualizado de los mismos.
Evaluacin de la eficiencia de los medios de cultivo
Cada lote se prueba antes de su uso, mediante la inoculacin de controles
positivos y negativos.
Protocolo de control de calidad.
1. Aspecto fisico: nivel, volumen, color, empaque.
2. Control de esterilidad: 5% de la produccin total se incuba durante 72 horas. Se
descarta o se acepta.
3. Control de ph.
4. Calidad microbiona: mtodo ecomtrico, cepas atcc.

CUESTIONARIO N3
MTODO ECOMTRICO: tcnica simple que permite recuperara,
comparar y cuantificar el crecimiento de microorganismos de referencia
(ATCC) con cargas de UFC definidas en los diferentes medios de cultivo.
Productividad: determina el rendimiento, recuperacin y crecimiento de
microorganismos que habitualmente se desarrollan en un medio de
cultivo.
Selectividad: evala la
que se espera que sea

supresin del crecimiento del microorganismo,

inhibido en medio.

PRCTICA N4
MTODOS DE
SIEMBRA

METODO ESTRA SIMPLE

Es para aislar una sola bacteria que estamos
sospechando. Se hace en muestras como: ORINA, LCR,
LIQUIDO PLEURAL. Lo mas importante de este mtodo es
para obtener colonias aisladas.

MTODO SIEMBRA POR

AGOTAMIENTO
Se hace en muestras como: ESPUTO, SECRECIN
VAGINAL, SECRECIN FARNGEA, y para obtener colonias
muy aisladas y separadas de las saprofitas con las
patgenas. Se hace tres agotamientos y una estria

MTODO SIEMBRA POR

INOCULACIN
Mayormente se realiza en caldos nutritivos y para hacer
un antibiograma. Y tambin se hace para potenciar el
crecimiento bacteriano

MTODO SIEMBRA POR

DISPERSIN

Es un mtodo usado
mayormente para realizar
antibiogramas a partir de
un inoculo de una cepa
obtenido a partir de una
muestra del paciente. Se
hace en 3 direcciones y
por agotamiento con un
hisopo estril.

MTODO SIEMBRA POR

PUNTURA + ESTRA
Se hace en medios diferenciales que tienen fondo y pico
como TSI y LIA y se hace con asa de siembra

CUESTIONARIO N4
1. CITE UN EJEMPLO DEL USO DE CADA TCNICA DE SIEMBRE.
.MTODO POR ESTRA O SIMPLE.
EJEMPLO: MUESTRAS DE ORINA EN AGAR MACCONKEY

.MTODO POR AGOTAMIENTO.

EJEMPLO: MUESTRA DE ESPUTO, SECRECIN FARNGEA EN AGAR SANGRE

.MTODO POR INOCULACIN.

EJEMPLO: MUESTRA PUNTAS DE CATTER EN CALDO TIOLGLICOLATO, PARA
REALIZAR ATB EN UNA SOLUCIN SALINA ESTRIL.

.MTODO DE DISPERSIN.
EJEMPLO: MAYORMENTE ESTE MTODO SE USA PARA REALIZAR UNA
ANTIBIOGRAMA EN AGAR MUELLET HINTON, DESDE UN INOCULO DE UNA
CEPA PURA DE MUESTRA PREVIO CRECIMIENTO EN LA SIEMBRA PRIMARIA.

.MTODO POR PUNTURA Y ESTRA.

EJEMPLO: ESTO SE REALIZA PARA DIFERENCIACIN BIOQUMICA EN AGAR
TSI Y LIA, DESDE UNA CEPA PURA PREVIO CRECIMIENTO DE MUESTRA QUE
FUE SEMBRADA.