TCNICAS

BIOQUMICAS:

CROMATOGRAF
DE
AINICO
INTERCAMBIO

FERNANDA FUENTEALBA
VALENTINA FUENTES
MACARENA LOBO
CARLA MORA
ROMINA PULVERMLLER
JONATHAN RIQUELME

FACULTAD DE MEDICINA
ESCUELA DE MEDICINA
BIOQUMICA
DOCENTES: Dr. REGINALDO DEL
POZO
BQ. MIRNA MUOZ
MIRCOLES 30 DE JUNIO DE 2010

CROMATOGRAFA
Mtodo usado principalmente para
la separacin de los componentes de
una muestra, en el cual los
componentes son distribuidos entre
dos fases:
Estacionaria
Mvil
Las retenciones pueden tener su
origen
en
dos
fenmenos
de
interaccin entre las dos fases:
Adsorcin
Absorcin

CROMATOGRAFA
Funciones:
Separar los
componentes de la
mezcla.
Medir las proporciones
de los
componentes.
Tipos:
Cromatografa plana
Cromatografa en
columna

CROMATOGRAFA
INTERCAMBIO
DE
INICO

Mtodo de separacin que permite la

separacin de molculas basada en sus
propiedades de carga elctrica.
Fase Estacionaria: Insoluble, lleva en la
superficie cargas electrostticas fijas que
retienen contraiones mviles que pueden
intercambiarse por iones de la fase mvil.
Fase Mvil: Disolucin acuosa con
cantidades moderadas de metanol u otro
disolvente orgnico miscible con agua que
contiene
especies
inicas
en
forma,
generalmente de buffer. Los iones de la fase

CROMATOGRAFA
INTERCAMBIO
DE
INICO

Principio: las molculas cargadas se adhieren a

los intercambiadores de forma reversible de
modo que dichas molculas pueden ser unidas o
desunidas cambiando el ambiente inico.
La separacin mediante intercambiadores inicos
se realiza por lo general, en dos fases:
1. Las sustancias a separar se unen al
intercambiador utilizando condiciones que
originan una unin fuerte y estable.
2. Se eluye de la columna con tampones de
diferentes pH o diferente fuerza inica,
compitiendo los componentes del tampn con
el material, por los sitios de unin.

PROPIEDADES DE
INTERCAMBIADORE
LOS
S
Intercambiador Inico: Polmero que
tiene grupos cargados unidos.
Intercambiador Catinico: Si un grupo est
cargado
negativamente,
podr
intercambiar iones positivos.
Un grupo tpico que se utiliza en los
intercambiadores de cationes es el grupo
sulfnico, SO3-. El grupo cido sulfnico es
un
intercambiador
de
cationes
fuertemente acido. Otros grupos de
utilizacin corriente son el carbonilo e
hidroxilo fenlico, dos intercambiadores

PROPIEDADES DE
INTERCAMBIADORE
LOS
S
Intercambiador Aninico:
Si el grupo cargado es
positivo,
es
un
intercambiador
de
aniones.
Los
intercambiadores
aninicos
dbilmente
bsicos ms corrientes son
grupos aminos alifticos o
aromticos.

MATERIALES
(1) Columna de vidrio
(2) Matriz de
intercambio inico
(Resina)
(3) Eluyente
(4) Muestra a
fraccionar
(5) Colectores.

PROCEDIMIENTO
Equilibrio: Toda la fase estacionaria se encuentra
asociada a iones complementarios (que pueden ser
cloro o sodio).

Aplicacin y Lavado: Aplicar la muestra la cual

queremos filtrar a travs de la columna mediante un
lavado especfico. Se aplica un buffer con el mismo pH y
fuerza inica que el buffer inicial para que todas las
protenas cargadas se unan al intercambiador.
Elusin: Las molculas captadas por el intercambiador
son eludas debido a cambios en la composicin del
buffer.

Regeneracin: Remover las partculas que an estn

PROCEDIMIENTO

ADSORCIN
/DESORCIN

ADSORCIN
-La fuerza de adsorcin
aumenta con el aumento
de carga neta.

DESORCIN
-Reducir
la
carga
neta
cambiando el pH
-Agregar un in que compita
por
las
cargas
del

GRADIENTE DE
NaCl
(A)

(B)

(C)

(D)

(E)

(A) Resina de intercambio catinico antes de aadir la

muestra.
(B) Se aade la muestra, una mezcla de Asp, Ser y Lys.
(C) Se aade Na+ (NaCl), el Asp, el aminocido con
menos carga positiva eluye el primero.
(D) Se aumenta el Na+, a continuacin eluye la Ser.
(E) Se aumenta el Na+, la Lys, el que posee ms carga
positiva eluye el ltimo.

VENTAJAS
/DESVENTAJAS
Ventajas:
Alta capacidad
Alta resolucin
Paso concentrador: Se puede sembrar un gran
volumen para luego eluirlo en un menor volumen.
Con una misma columna se puede utilizar a
diferentes pH y obtener diversos perfiles de
elucin.
Desventajas:
Las muestras deben estar desalinizadas antes de ser
aplicadas a este tipo de cromatografa

TIEMPO DE
RETENCIN

Tiempo que un compuesto tarda en salir de la

columna.
Se basa en la atraccin entre iones del soluto y la
carga complementaria de la fase estacionaria. Los
intercambiadores inicos favorecen la unin de iones
de mayor carga y radio inferior. Cuando la retencin de
los compuestos se ve afectada, se favorece la elusin

pH
Los intercambiadores inicos se
clasifican en cidos o bsicos, fuertes
o dbiles.
Las resinas cidas fuertes siguen
ionizadas incluso en disoluciones muy
cidas, en cambio las resinas cidas
dbiles se protonan a un pH prximo a
4 y pierden su capacidad de
intercambio catinico, reducindose
as, el tiempo de retencin.
Los grupos muy bsicos de amonio
cuaternario siguen siendo catinicos a
cualquier valor de pH. Los bsicos
dbiles de amonio terciario se
desprotonan
en
disoluciones

CARGAS

La fuerza de enlace de la muestra depende de la

magnitud de la carga. La fuerza de retencin es
mayor y, por consiguiente la de elusin es menor,
mientras ms cargado se encuentre el compuesto,
ya sea negativa (aniones) o positivamente

CARGAS

Los iones polivalentes

se unen con mayor
fuerza
a
la
fase
estacionaria que los
monovalentes.

GRADIENTE

Aumentando la
concentracin de
la fase mvil, los
iones
compiten
cada vez ms
favorablemente
con la muestra
por
los
sitios
activos cargados
de
la
fase

POROSIDAD
poro pequeo
(menor de 600)

poro grande
(mayor de
600)

En membranas cuyo tamao de poro es pequeo no

hay espacio suficiente para unir el in dentro de
dichos poros por lo que la cantidad de intercambiador
por unidad de superficie es menor.
En membranas con tamao de poro mayor, se
puede unir el compuesto mvil dentro de dichos
poros, con lo que se incrementa la cantidad de
intercambiador por unidad de superficie. La porosidad

SUPRESORES
DE IONES

La conductividad de la fase
mvil se hace muy elevada
debido a la alta concentracin
inica necesaria para eluir a la
mayora de los iones; esto hace
muy difcil la deteccin de
pequeas concentraciones de
analito.
Este problema se resolvi
mediante un sistema supresor de
conductibilidad colocado a la
salida
de
la
columna
cromatogrfica.
Los primeros supresores fueron
columnas de intercambio inico

CROMATOGRAMA
El cromatograma es el
resultado grfico de la
cromatografa. En el caso
de separacin ptima, los
diferentes
picos
o
manchas
del
cromatograma
se
corresponden
a
los
componentes de la mezcla
separada.
La posicin de los
mximos nos indica el in
presente
(carcter

CROMATGRAFO
Una
vez
separada,
la
muestra pasa a travs del
detector donde se registra la
seal obtenida respecto al
tiempo de retencin.

Registran
cromatogramas.

los

Se
emplean
en
la
determinacin de fluoruros,
cloruros, nitritos, nitratos,
bromuros fosfatos y sulfatos.

APLICACIONES
MEDICIN DE LA
HEMOGLOBINA
GLICOSILADA.
DETERMINACIN DE
PBG Y ALA EN LA
ORINA.

HEMOGLOBINA
GLICOSILADA
El porcentaje de protena unida a la
glucosa es lo que se denomina
hemoglobina glicosilada (HbA1).
Cuanto mayor es la cantidad de
glucosa en la sangre, ms se une a
las protenas y su porcentaje de
unin indica cual ha sido la cantidad
media de glucosa circulante durante
el
tiempo
de
vida
de
la
hemoglobina.
Como los eritrocitos son fcilmente
permeables a la glucosa, el nivel de
la HbA1 en una muestra de sangre
facilita la historia glicmica de los

HEMOGLOBINA
GLICOSILADA
HbA1c
(%)

Calificacin

5-6

Promedio de
Glicemias
(mg/dl)
80-120

6-7

120-150

Muy Bueno

7-8

150-180

Bueno

8-9

180-210

Regular

9-10

210-240

Problemtico

10-11

240-270

Malo

11-12

270-300

Muy Malo

Excelente

HEMOGLOBINA
GLICOSILADA

HEMOGLOBINA
GLICOSILADA

El mtodo de cromatografa de intercambio

inico se basa en la elusin diferencial de la
hemoglobina glicosilada por el cambio de carga
que se produce en la molcula debido a la
glicacin del grupo amino terminal de la cadena.
Para realizar el procedimiento se utiliza

PBG Y ALA
EN ORINA
Porfirias: grupo de enfermedades
de origen gentico o adquirido.
Existe alteracin en la actividad de
una o varias enzimas de la va
metablica delgrupo HEM, lo que
ocasiona
niveles
anormalmente
elevados
de
porfirinas
o
sus
precursores
(cido
deltaaminolevulnico
[ALA]
y
porfobilingeno [PBG]).
Estos se acumulan en los tejidos y
se excretan en la orina y las heces.
Las manifestaciones patolgicas son

PBG Y ALA
EN ORINA
La Porfiria Intermitente Aguda (PAI) es un
desorden autosmico dominante, que causa
deficiencia parcial de la actividad de la
porfobilingeno desaminasa (PBGD), tercera
enzima de la ruta de sntesis del grupo HEM.
Cuando los pacientes con PAI presentan una
crisis aguda, disminuye la actividad de la PBGD y,
como consecuencia los niveles de BPG y/o ALA en
la orina se incrementan significativamente.
Durante la crisis aguda, el PBG urinario aumenta
de 20 a 200 mg/da, cuyos valores de referencia
son de 0-4 mg/da, y la excrecin de ALA se eleva
aproximadamente a la mitad, 10-100 mg/da,

PBG Y ALA
EN ORINA
El mtodo de Mauzerall-Granick es el ms usados para la
cuantificacin de estos dos precursores. Se basa en la
tcnica de cromatografa de intercambio inico, en la cual
se utilizan columnas con resinas aninicas y catinicas.
El PBG se queda retenido en la aninica y el ALA en la
catinica. En la columna con PBG, se utiliza cido actico
1M para que ste eluya y pueda ser cuantificado. En la
columna con ALA, se le agrega acetato de sodio 1M para
que ste eluya y sea cuantificado. Luego, el eluido de cada
columna reacciona con Reactivo de Ehrlich, formando un
producto rojo intenso. Este reactivo est conformado por 4dimetilbenceno diluido en cido actico y cido perclrico.
El producto es medido espectrofotomtricamente a 553
nm, y a partir de esta medicin se puede calcular la

OTRAS
APLICACIONES

Extraccin y purificacin de cidos nucleicos

Purificacin de agua
Purificacin del fibringeno de la leche
Determinacin de anticonvulsantes en el
suero despus de la extraccin de la fase
slida.
Anlisis de antibiticos de politer
Determinacin de pesticidas.
Identificacin de cidos orgnicos en la fruta y
en el jugo.
Deteccin de derivacin-fluorescencia postcolumna para anlisis para varios tipos de
pesticidas agrcolas .
Determinacin de metabolitos de Triptofan en
el suero umbilical.

CONCLUSIONES
Extraccin y purificacin de cidos nucleicos
Purificacin de agua
Purificacin del fibringeno de la leche
Determinacin de anticonvulsantes en el
suero despus de la extraccin de la fase
slida.
Anlisis de antibiticos de politer
Determinacin de pesticidas.
Identificacin de cidos orgnicos en la fruta y
en el jugo.
Deteccin de derivacin-fluorescencia postcolumna para anlisis para varios tipos de
pesticidas agrcolas .
Determinacin de metabolitos de Triptofan en
el suero umbilical.