54 Tcnicas de Biologa Molecular

3 parte de tres

Libro
Fundamentos y Tcnicas de Anlisis
Hematolgicos y Citolgicos
Ed. Paraninfo: Pg. 473

IES Miguel de Cervantes. Murcia

Ciclo Laboratorio de Diagnstico Clnico
Fundamentos y Tcnicas de Anlisis Hematolgicos

Jos ngel Pina Alburquerque

HIBRIDACION DE CIDOS NUCLEICOS

Southern blot
Desarrollada
por Edwin
Southern
en 1975

Fundamento: Fijacin de sondas de ADN, previamente

marcadas a cidos nucleicos diana por complementariedad de
bases.

HIBRIDACION DE CIDOS NUCLEICOS

Southern blot

Permite la
deteccin de
secuencias
genmicas
concretas en
una mezcla
de ADN
(cortado con
enzimas de
restriccin).

HIBRIDACION DE CIDOS NUCLEICOS

Southern blot
Previamente el ADN
diana debe
desnaturalizarse para
separar sus dos cadenas
Las sondas son
oligoncletidos de 15
100 nucletidos
diseados
especficamente para
hibridar con el ADN diana
(complementarios).

Se separan los fragmentos en funcin de su tamao por

electroforesis en gel de agarosa y se transfieren a una
membrana de nitrocelulosa o naylon.

HIBRIDACION DE CIDOS NUCLEICOS

Southern blot
Marcaje de la
sonda para su
deteccin.
Istopo radiactivo:
Se detecta por
autorradiografa.
Biotina que
reacciona con
avidina conjugada
con enzimas
Reaccin
colorimtrica.

HIBRIDACION DE CIDOS NUCLEICOS

Southern blot
Se puede utilizar
para el diagnstico
molecular de
patologas genticas
Se han desarrollado
tambin:
Northern blot: ARN
Western blot:
Protenas.

Mapeo del cromosoma X mediante corte con enzimas de restriccin y

anlisis por Southern blot (en European Journal of Human Genetics).

HIBRIDACION DE CIDOS NUCLEICOS

Chips de ADN (MICROARRAYS)

Es una superficie slida a

la cul se unen una serie
de fragmentos de ADN.
Se usan para analizar la
expresin diferencial de
genes.
Similar al Northern blot, pero
se estudian miles de genes
de forma simultnea.

HIBRIDACION DE CIDOS NUCLEICOS

Chips de ADN (MICROARRAYS)

Aplicaciones
Estudio de genes que se
expresan diferencialmente
(Ej. sanos/enfermos)
Identificacin de genes
caractersticos de una
patologa.
Prediccin de respuesta a un
tratamiento.
Deteccin de mutaciones de
un solo gen y polimorfismos
de un nico nucletido
(SNP).

Detalle de la pantalla de resultados de un

Array para tipado de papiloma humano.
Se observa
resultado
positivo para
los tipos 59, 61
y 16.
Aparecen tres
veces cada
uno, al igual
que el control
interno.

SECUENCIACIN

Frederick Sanger
Premio Novel de Qumica
en 1958 y 1980

Se basa en el mtodo
de Sanger.
Usa una replicacin in
vitro catalizada por
una DNA polimerasa.
Se produce una
interrupcin
controlada de la
sntesis de una hebra
complementaria a la
que se quiere
secuenciar.

Adems de utilizar cebadores y dNTP, se emplean

tambin ddNTP (didesoxinucletidos) que producen la
terminacin de la sntesis cuando se unen a la cadena.

SECUENCIACIN
Se obtienen fragmentos
de diferente longitud, que
comienzan con el
cebador en 5 y terminan
en uno de los cuatro
ddNTP
En el mtodo actual de secuenciacin automtica:
Los ddNTP estn unidos a 4 fluorocromos distintos
(uno para cada didesoxinucletido).
Tras separacin electrofortica se detectan
mediante un laser y un fotodetector.
Combinando los resultados de cada fragmento se
puede deducir la posicin de cada nucletido.

SECUENCIACIN

Resultado de la secuenciacin

Homologa de secuencia
GenBank es una base de datos en la que se almacenan todas las
secuencias de ADN.
Para hacer test de homologa se realiza una bsqueda mediante una
herramienta llamada BLAST
Se introduce una secuencia y se obtiene una lista de todas las
secuencias almacenadas que se parecen a la secuencia introducida,
ordenada de mayor a menor grado de similitud.

Alineamiento de secuencias generado por ClustalW entre dos protenas

dedos de zinc identificadas por el nmero de acceso GenBank
(Ejemplo en genbank: Secuencia de una hemoglobina beta).

Alineacin de las secuencias obtenidas de una muestra con HIV y las de la base
de datos del HIV Drug resistance Database.

Aplicacin de Tcnicas de Biologa Molecular:

Deteccin de polimorfismos
Muchas regiones del
genoma humano
presentan un alto grado
de diversidad
Estas secuencias
variables o polimrficas
tienen utilidad en el
diagnstico de
enfermedades, pruebas
forenses y pruebas de
paternidad.
Muchos polimorfismos se encuentran en regiones que no
codifican protenas (99 % del genoma).

Aplicacin de Tcnicas de Biologa Molecular:

VNTR (Variable Number Tandem Repeat)

Lugares del genoma que representan un tipo de polimorfismo donde una

breve secuencia de nucletidos se repiten en tandem.
Se pueden encontrar en muchos cromosomas.

Presentan variaciones de longitud entre individuos.

Se denominan tambin:
Microsatelites
Minisatelites

Su anlisis es til en gentica, biologa de investigacin y anlisis forense.

Se usan para identificacin personal o parental.
Para saber ms:

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/3856104
http://en.wikipedia.org/wiki/Variable_number_tandem_repeat
http://es.wikipedia.org/wiki/Microsat%C3%A9lite

http://www.biologia.arizona.edu/human/problem_sets/DNA_forensics_1/05t.html

VNTR: Microsatlites
SSR (Short Sequence Repeat) o STR (Short Tandem Repeat)
Son secuencias de ADN en las que un fragmento pequeo (pocos
nucletidos) se repite de manera consecutiva.
La variacin en el nmero de repeticiones crea diferentes alelos los
cuales se distinguen entre s por la longitud total del fragmento.
Generalmente se encuentran en zonas no codificantes del DNA.
Son muy polimrficos (con diferentes tamaos).
Son utilizados como marcadores moleculares: Identificacin de
parentescos y estudios de poblaciones.

http://www.investigacionyciencia.es/03003458000524/Microsat%C3%A9lites_de_ADN.htm

Aplicacin de Tcnicas de Biologa Molecular:

Deteccin de polimorfismos
Se pueden detectar de dos maneras:

RFLP (Restriction
Fragment Length
Polymorphism):
Polimorfismos en la
longitud de los
fragmentos de
restriccin: Por
hibridacin con sonda
radiactiva (Northern blot)
tras digerir el DNA
genmico con enzimas
de restriccin que no
corten en la secuencia
repetida.

VNTR: Por PCR con cebadores que flanqueen la VNTR y

separacin con electroforesis en gel.

Aplicacin de Tcnicas de Biologa Molecular:

Deteccin de polimorfismos

Aplicacin de Tcnicas de Biologa Molecular:

Deteccin de polimorfismos

Aplicacin de Tcnicas de Biologa Molecular:

Deteccin de polimorfismos
El patrn de bandas obtenido se denomina huella molecular de DNA
En anlisis forense se suelen utilizar de 4 a 6 VNTR diferentes.

VNTR

Electroforesis en gel de agarosa mostrando variaciones en tamao de

diferentes alelos de VNTR (D1S80) en 6 individuos (tras PCR)
Ver: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1682638/pdf/ajhg00075-0159.pdf
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1682756/pdf/ajhg00085-0141.pdf