IDENTIFICAÇÃO E ESTUDO DAS

CARACTERÍSTICAS

FISIOLÓGICAS DE Saccharomyces cerevisiae

PRESENTES EM FERMENTAÇÃO ESPONTÂNEA

DE

CANA-DE -AÇÚCAR

Orientado: Alexandre Tourino Mendonça

Orientador: Rosane Freitas Schwan

 Introdução
Histórico:

 produção de bebidas através de

fermentação alcoólica remonta
milhares de anos (Aquarone et al.
1986).

 prática em decorrência da pedra

filosofal (Maia et al, 1993).

 Brasil no início da colonização;

difundida a partir de 1945
(INDI,1882)
 Produção :

 Brasileira - 1,2 bilhões (Martin,

1997).

 Minas gerais - 120 milhões de

litros
(Martin,1997).

 Visão geral

 Programa Mineiro de Incentivo à

produção
OBJETIVOS:

 Isolar e identificar, as leveduras por

métodos tradicionais e moleculares.

 Selecionar as que apresentarem

melhores características
fermentativas.
fermentativas
Processo fermentativo :

 Substrato:
• caldo de cana-de-açúcar
• 78 a 86% sacarose
• 10 a 20% de açúcares redutores
• 0,3 e 0,5% de cinzas
• compostos nitrogenados 0,5 a 1,0%
• pH 5,2 a 6,8 (Lima, 1975)
 Inóculo:
• Fermento caipira ⇒ fubá, farelo de
arroz, suco de limão ou laranja azeda
(Neder, 1957).

• Milho e arroz de boa qualidade, pH do

pé-de- cuba 4,0 a 3,5 (Silva, 1995).

• principal desvantagem desuniformidade

 SISTEMA DE FERMENTAÇÃO:

• Batelada simples (Aquarone et. al., 1986;

Oliveira,1993).

• Batelada alimentada (Maia et al., 1995)

• Processo contínuo (Silva, 1995 ; Alves, 1994)

 Levedura:

• Local: folhas, frutos, grãos de cereais,

etc.
(Kurtzman and Fell, 1998).

• Saccharomyces cerevisiae ⇒ +
utilizada em
fermentações industriais (Kurtzman
and
Fell, 1998)
 IDENTIFICAÇÃO DE LEVEDURAS:

• Classificação ⇒ fisiológicos e
morfológicos
(Kurtzman e Phaff, 1987; Barnett et al.,
1990;
Kurtzman and Fell, 1998).
• Kits de identificação : Api System, Any
Analbalab Products Anc., Nunclon Delta
S1 ⇒
pouca abrangência (Fleet e Mian, 1987 ;

Augustyn, 1991).
• Identificação molecular (%G+C) (Nakase
e
 PRODUTOS ORIUNDOS DA FERMENTAÇÃO:

1 - Etanol: produzido em maior quantidade.

• utilizado para fabricação de combustível e

bebidas.
- principais bebidas produzidas por
fermentação
são:
- fermentadas: cerveja, vinho, cidra;
- destilada: aguardente, rum, uísque,
“saque” (Walker, 1998).
 Tabela de bebidas alcoólicas:

Bebida Cerveja Uísque Vinho Destiladas

Matéria Prima cevada + Cevada Uva Cevada, milho,
(arroz e milho) (malte), melaço, uva,
cevada, trigo soro de leite,
etc.
Pré- Fermentação do fermentação esmagamento variável
tratamento malte maceração dependendo do
substrato
Fermentação S.cerevisiae S. cerevisiae S. cerevisiae S. cerevisiae e
flora natural K. marxianus
(soro de leite)
Reciclagem de Sim Não Não Não
levedura
Destilação Não Sim Não Sim
Maturação Pouca longa (anos) longa (anos) Sim
Álcool final % 3–6 40 – 45 8 – 12 35 – 56
(v/v)
Adaptado de Walker, 1998.
• Etanol pode ser usado como fonte de

carbono (Red e Peppeler, 1973).

• Crescimento aeróbico em etanol é baixo

(Strathern et al., 1982).

2 - Glicerol, ácido succínico, ácido
acético.

• Glicerol e ácido succínico produtos

secundários produzidos em maior
quantidade (Jennings, 1984)

• Composto importante para o

“flavour” de
bebidas alcoólicas (Omori, 1976)

• Metabólito osmoregulador (Jovall et

al.,
• Ácido succínico 60% da produção primeira
hora de
fermentação (Basso et al., 1996)

• produzido ⇒ leveduras (Alves, 1994)

• isolando-se o pH ⇒ ácido succínico ⇒ação

sinergística com etanol ⇒ efeito
antimicrobiano
(Basso et al., 1994).

• ácido acético ⇒ contaminação bacteriana

 Identificação de Saccharomyces
cerevisiae por técnicas tradicionais e
moleculares.

• Introdução:
- Diferenciação entre leveduras
Saccharomyces e não-
Saccharomyces
(Martin, 1997).

- Técnicas empregadas; Kits de

identificação, testes bioquímicos e
fisiológicos, técnicas moleculares entre
• Objetivo:

- Identificar leveduras Saccharomyces e

não- Saccharomyces , isoladas a partir da
fermentação alcoólica para a produção de
aguardente, por métodos tradicionais
(teste bioquímicos e morfológicos) e pela
técnica de PCR.
Material e Métodos:

• Amostragem: 10 alambiques no Sul de

Minas Gerais.
• Processamento da amostra: WL (Difco);
YW
pH 3,5 e CCL.
• Isolamento e purificação.
• Identificação:
 Método tradicional de identificação:
 Fermentação de carboidratos:
 Assimilação de compostos de
carbono e nitrogênio.
 Osmotolerância a 10%.

 Resistência à cicloheximida.
 Crescimento a 35 e 37°C.
 Microcultivo.
 Técnica de PCR (Reação em cadeia da
polimerase):

• PCR- três fases:

- Desnaturação ⇒ 94°C por 5 minutos;

- Anelamento ⇒ 61°C por 30 segundos;

- Extensão ⇒ 72°C por 5 minutos.

 Amostra + Solução Enzimática

25ºC/30’

Master Mix
Taq dNTP Tampão Primer Água

Master Mix + Amostra

Termociclador

Cuba de eletroforese
50 min a 150 V
Análise por PCR das leveduras
- Presença de bandas indica linhagens de
Saccharomyces cerevisiae
- Ausência de bandas - não - Saccharomyces

DNA não
amplificado

DNA
amplificado

Local de
aplicação da
amostra de
DNA
 Amostras de DNA +
tampão de corrida
DNA + tampão

Local onde houve Local onde

a amplificação do não houve
DNA amplificação
de DNA
RESULTADOS E DISCUSSÃO:

 Análise das amostras:

• produtores que fazem diluição do caldo e

suplementam o caldo com ingredientes (Fubá
), tem melhores rendimentos.

• fermentações que apresentaram

predominância da espécie Saccharomyces
cerevisiae não tiveram problemas de
fermentação.
 Parâmetros físicos-químicos do
mosto de cana-de-açúcar.
A lam b iq ue T e m p er aturºC
a () pH
eta no l (% )
Ar m o sto
1 24 28 3 ,5 0 6 .2
2 25 30 3 ,7 0 6 .5
3 25 29 3 ,8 0 7 .0
4 27 30 3 ,0 0 4 .0
5 27 25 3 ,9 0 5 .0
6 25 32 3 ,2 0 4 .8
7 22 30 4 ,1 0 3 .5
8 25 31 3 ,2 0 6 .0
9 27 32 3 ,1 8 7 .0
10 25 30 4 ,0 0 6 .1
 População leveduriforme encontrada
em 10 alambiques no Sul de Minas Gerais
Leveduras
7
Alambique (UFC/ml x 10 ) Espécies (números de isolados)
1 2,2 S.cerevisiae (29), não –Saccharomyces (7)

2 40 S.cerevisiae (27), não –Sccharomyces (9)

3 40 S.cerevisiae (30), não –Saccharomyces (7)

4 2,2 S.cerevisiae (20), não –Saccharomyces (11)

5 40 S.cerevisiae (18), não –Saccharomyces (15)

6 30 S.cerevisiae (8), não –Saccharomyces (21)

7 10 S.cerevisiae (6), não –Saccharomyces (24)

8 100 S.cerevisiae (22), não –Saccharomyces (8)

9 9,0 S.cerevisiae (24), não –Saccharomyces (8)

10 9,0 S.cerevisiae (17), não –Saccharomyces (11)

 Identificação do gênero Saccharomyces :

• Técnica tradicional:
- Dos 387 isolados 132 foram
identificados como
S. cerevisiae.

• Técnica molecular PCR:

- Dos 387 isolados 158 foram
identificados como
S. cerevisiae.
 Caracterização bioquímica e
molecular de Saccharomyces
Fermentam: cerevisiae
Glicose, sacarose e frutose.

Assimilam: Galactose, trealose, D-xylose,

D-manitol, Sacarose, Lactose, L-
arabinose, Ác. Succinico, Maltose,
Rafinose, D-ribose, Ác. Cítrico .
Não assimilaram: nitratos de potássio,
eritritol e M-inositol e celobiose.
Não apresentaram crescimento: meio sem
vitamina , 100 e 1000ppm de
cicloheximida, não formaram película
quando crescida a 35 e 37°C, não
apresentaram resposta positiva ao teste
de osmotolerâcia com 10% de NaCl .
 Comparação entre o método tradicional e a
técnica
de PCR:

• Técnica tradicional pode levar a erros de

leitura que serão detectados pelo PCR já que
esta técnica é mais sensível.
 CONCLUSÕES:

• Considerando rapidez e sensibilidade, a

técnica PCR pode ser utilizada para a
identificação de leveduras contaminantes.

• Da mesma forma pode ser possível

acompanhar durante a safra a permanência
ou não do fermento empregado inicialmente.

• Limitação da técnica de PCR - dependente

do conhecimento do genoma do
microrganismo em estudo.
estudo
 Estudo fisiológico das leveduras
fermentativas.

• Introdução
- Saccharomyces cerevisiae - principal agente
biológico para conversão de açúcar a etanol.

- Capacidade de produção da toxina “Killer”

- Microrganismo com alta capacidade de

produção
alcoólica.
• Objetivo:

- Selecionar o isolado de Saccharomyces

cerevisiae de melhor adaptação e
produção alcoólica, para ser aplicado
para a produção de aguardente.
• Material e Métodos:

- Microrganismos

* 158 isolados identificados como

Saccharomyces cerevisiae .

- ”Screening” da capacidade fermentativa:

* tubos de ensaio com tubos de Durham

invertidos ⇒ meio basal + carboidrato
(Glicose,
sacarose e frutose).
- Fermentação em Erlenmeyer
* 50 isolados de Saccharomyces
cerevisiae , que apresentaram produção de
CO2 em menor tempo.
* frascos com meio de cultura MF,
esterilizados e inoculados, com cultura com 24
horas de crescimento.
* inóculo padronizado para ⇒ABS
600mm.
* amostras retiradas com: 2, 8, 12, 24 e
36 horas após a incubação.
* análises cromatográficas: etanol,
glicose, frutose; utilizando cromatografia
líquida de alta pressão (HPLC).
- Fermentação em pequena escala (2 litros)

* levedura: CA 116 - fermentador de

bancada
(LH. SGI - 2 L)

* dois meios: MF ⇒ biomassa; Caldo de

cana-de
açúcar diluído ⇒ fermentação
propriamente
dita.

* 5 bateladas sucessivas .
• RESULTADOS E DISCUSSÃO:

-”Screening” de fermentação

* Foram selecionadas as leveduras

Saccharomyces cerevisiae que
apresentaram
produção de CO2 em menor tempo em

glicose, frutose e sacarose.

Avaliação da capacidade fermentativa de
isolados de Saccharomyces cerevisiae.
12 horas
I solados de levedura glicose sacarose frutose
33 220 15 218 28 141 155 525 508 135
140 139 111 76 162 108 123 498 261 128 3/ 3 3/ 3 3/ 3
164 486 271 222 36 96 262 245 272 112
503 163 509 363 116 143 85 526 506 160
208 515 219 250 251 264 467 159 387
147
14 213 214 78 92 101 117 118 246 493
494 468 471 149 75 21 153 138 08 522 2/ 3 2/ 3 2/ 3
93 403 405 470 469 79 81 82 12 27 402
35 432 438 447 113 449 439 453 457 129
130 150 216 132 133 136 37 145 146 148
445 253 263 265 266 267 472 475 476
485 163 164
268 511 273 347 358 510 496 499 490
317 207 332 269 156 466 464 157 158 1/ 3 1/ 3 1/ 3
161 178 197 198 199 203 209 211
* 50 isolados de Saccharomyces

cerevisiae

fermentaram glicose, frutose e

sacarose

com a mesma velocidade.

- Fermentação em frascos:

* produção de etanol foi inversa ao

consumo
de glicose.

* 24% de glicose foi consumida nas

primeiras
horas de fermentação⇒multiplicação
celular

* produção de etanol pequena 36 µ molar

Consumo de glicose e produção de etanol

120 60

100 50

80 40

glicose
etanol

etanol
60 30
glicose
40 20

20 10

0 0
1 2 3 4 5 6
t
 * após 8 horas ⇒ fermentação
propriamente dita.

* produção máxima 12 horas

(melhores leveduras).

* pH não interferiu na atividade das

leveduras.

* melhor rendimento e
produtividade levedura CA 116.
 Produtividade de etanol com 12
horas de fermentação.
Levedura Protdutividade Produtividade de Produtividade de
etanol/ biomassa etanol /ART etanol/tempo de
fermentação
525 0.1624 0.4807 0.4006
76 0.1077 0.4873 0.3980
108 0.0965 0.5059 0.4172
123 0.1840 0.5009 0.4140
128 0.1155 0.5515 0.4544
164 0.1244 0.5473 0.4495
486 0.1555 0.4827 0.3992
271 0.1727 0.5205 0.4304
503 0.1700 0.5101 0.4236
509 0.1301 0.4923 0.4088
116 0.1862 0.5863 0.4873
143 0.1005 0.4696 0.3886
506 0.1059 0.5116 0.4241
160 0.115 0.5125 0.4241
208 0.1660 0.4647 0.4116
Rendimento em percentagem de
etanol produzido.
RENDIMENTO ( % )
LEVEDURA 12 HORAS 24HORAS
525 74.30 70.76
76 73.82 71.00
108 77.38 59.09
123 76.78 67.74
128 83.88 67.71
164 83.36 67.20
486 74.03 64.65
271 79.82 68.01
503 78.57 72.56
509 75.82 62.08
116 90.38 74.85
143 72.08 67.33
506 78.65 52.78
160 76.34 53.49
208 71.87 59.60
- Fermentações em bateladas
sucessivas

* O rendimento e a produtividade do
isolado CA 116 foi comprovado em 5
bateladas .

* O maior rendimento e produtividade

observado na última batelada pode
ter sido devido a uma maior
adaptação da levedura ao meio de
cultura (caldo de cana-de açúcar).
 Rendimento e produtividade da
levedura CA 116 em cinco bateladas.

Batelada Batelada Batelada Batelada Batelada

1 2 3 4 5
Etanol/biomassa 0.9388 0.7875 0.5329 2.5345 2.5688
Etanol/ART 0.3333 0.1898 0.1974 0.5807 0.7406
Etanol/tempo 0.3130 0.2867 0.2998 0.7904 0.9834
Rendimento 58 53 55 90 95
%
• CONCLUSÕES

- A produção de etanol foi significativamente

diferente para as linhagens de
Saccharomyces cerevisiae testadas.

- De um total de 158 isolados, cinqüenta

foram selecionadas pelo testes de Durham
com bom índice fermentativo.

- Quinze dentre as cinqüenta S. cerevisiae

produziram maior quantidade em torno de
110 µmolar em média, estatisticamente elas
foram iguais no período 12 horas de
- A levedura CA 116 foi selecionada
por ter apresentado a mais alta
produtividade e maior rendimento
alcoólico.

- A CA 116 apresentou a
importante característica de
floculação.
 AGRADECIMENTIOS

À Profa. Dra. Rosane Freitas Schwan.

À Profa. Dra. Eliana Pinheiro de Carvalho.
Aos Profs. Alan Wheals e Eustáquio Souza Dias.
Aos colegas de laboratório (Sílvia, Charles, André,
Cláudia, Cristina, Míriam, Valéria, Daniela, João,
“Carolinas” e Márcio).
Aos amigos Ivana, Beto, Joelma, Dulcinéia, Creuza,
Newton, Cidinha, Janaína, Débora, Kelly e Margarita.
Às secretárias Gicelda e Andreia.
Aos colegas do DCA
Aos Professores do DCA e funcionários do DCA,
Biblioteca, DBI, PRPG e DRCA pela atenção.
Enfim a todos que direta ou indiretamente
colaboraram para a realização deste trabalho.