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Princpios e Processos
Objetivos
Conceitos
e
fundamentos
processos biotecnolgicos;
Obteno de Produtos
Vacinas
Anticorpos monoclonais
Biomateriais
Biomedicamentos
dos
O que BIOTECNOLOGIA?
biolgicos
para
prover
bens
assegurar
servios.
Microbiologia, Bioqumica, Gentica,
Engenharia, Qumica, Informtica
CONHECIMENTO
AGENTES BIOLGICOS
BIOTECNOLOGIA
BENS
SERVIOS
Biotecnologia Tradicional
T c ni ca s
Pr ocesso s F er me ntati vo e
En zi m ti co
Ap lic ae s
Di ve rsas Aplica es I ndu striais:
a ntibi ti cos, ci do s, l cooi s,
vi ta min as, a mino cid os,
al i mentos e be bi da s.
So ja , F ei jo
Cult ura de Te ci d os
Pr odu o de mu d as
Extr ao Biol gi ca
Biotecnologia Moderna
T nic as
Ap l ic ae s
DNA
Rec o mbi na nte
Ant i co rpo
Mo nocl o na l
Ge n mica
Biotecnologia
De acordo com a European Federation
of Biotechnology (EFB), a biotecnologia
engloba tanto a viso tradicional
quanto a biotecnologia molecular.
Para a EFB, a biotecnologia a
integrao das cincias naturais e
organismos, clulas, suas partes e
anlogos moleculares para produtos e
servios.
Histrico
Herbert Boyer
1969: Estudos com enzimas de
restrio de E. coli
Ataque stios especficos da molcula
de DNA;
Capacidade de unir duas fitas de DNA
de modo bastante preciso.
Histrico
Stanley Cohen
Estudos com molculas de DNA circulares
que localizavam-se livres no citoplasma
de certas bactrias: plasmdeos.
Replicao
independente
do
DNA
cromossmico;
Desenvolveu mtodos para a remoo dos
plasmdeos da clula;
Conseguiu inserir plasmdeos em outras
clulas;
Histrico
Boyer e Cohen
Combinaram os processos de uso de
plasmdeos e DNA recombinante (enzimas de
restrio).
Recombinao de segmentos de DNA com
determinada configurao;
Insero destes produtos em plasmdeos;
Introduo dos plasmdeos recombinantes em
bactrias;
Produo de protenas especficas;
Base da Biotecnologia.
Biotecnologia
Conjunto de tcnicas que utilizam organismos vivos ou
suas enzimas para produzir produtos e processos teis
ao homem.
Produo de po, coalhada, vinho (processos mediados por
microorganismos) esto relacionados biotecnologia.
Muitos processos
biotecnolgicos:
podem
ser
classificados
como
Princpios da Biotecnologia
Duas tcnicas estabeleceram a biotecnologia
moderna:
Engenharia gentica e Biologia Molecular
Biotecnologia
Vantagens das substncias obtidas:
No esto contaminadas;
So mais facilmente purificadas;
So mais especficas;
Produo em larga escala.
Desvantagens
produzidas:
das
substncias
Transferncia Gnica
Transgnicos:
Seres que contm sequncia gnica de
organismos de espcie distinta.
Cisgnicos:
Seres que contm sequncia gnica de
outro organismo da mesma espcie, ou
entre
espcies
que
se
cruzam
naturalmente.
Engenharia Gentica
Engenharia Gentica
Etapas bsicas:
Identificao da sequncia gnica de interesse;
Isolamento/sntese do gene de interesse;
Insero
do
gene
em
um
vetor
de
transferncia/expresso;
Transferncia do vetor ao organismo alvo da
manipulao;
Transformao do organismo alvo;
Seleo dos organismos geneticamente modificados;
Manuteno do gene no OGM;
Habilidade do OGM de transferir o gene sua prognie
Clonagem Molecular
Obteno de mltiplas cpias de um
fragmento de DNA de interesse:
Fragmentao;
Amplificao;
Ligao;
Transfeco/Transformao;
Seleo;
Produo.
Plasmdeo: vetor de
clonagem
Caractersticas importantes:
Origem de replicao;
Stio de Mltipla Clonagem (MCS):
polilynker.
Enzimas de Restrio;
Marcador seletivo;
DNA ligase;
Capacidade de unir duas sequncias de
DNA.
HISTRICO
Watson & Crick
Estrutura do
qumica do DNA
(1953)
Tecnologia DNA
recombinante
Insulina recombinante
(1978)
Ian Wilmut
clonagem de mamfero
(1997)
HISTRICO
PGH
Conhecer genoma H. sapiens
(1995-2003)
Transgenia
(1995...)
Prtica clnica
Testes genticos
(1995...)
Tecnologia do DNA
recombinante
DNA recombinante:
Molcula de DNA formada pela ligao
de duas molculas de origens diferentes
(Ex. DNA de planta ligado a um
plasmdeo).
Nucleases e Enzimas de
Restrio
Nucleases e Enzimas de
Restrio
Enzimas
de
restrio
so
classificadas como endonucleases
stio-especficas, e so extradas de
procariontes.
Proteo contra infeco por
bacterifagos.
Enzimas de Restrio
Nomenclatura:
1 letra: gnero
2 e 3 letras: espcie da qual a enzima foi
extrada;
As 3 primeiras letras devem estar em
itlico.
Pode haver uma letra que indique a cepa
(strain);
Algarismos romanos ao final indicam a
ordem de isolamento das enzimas.
Enzimas de Restrio
Exemplo:
A enzima BamHI reconhece a seqncia
abaixo, na dupla fita de DNA.
Por reconhecer seqncia especfica de
nucleotdeos no DNA, atua como uma
verdadeira tesoura molecular.
Enzimas de Restrio
Outros exemplos:
BamHI - Bacillus amyloliquefaciens H
5 G/GATCC 3
Enzimas de Restrio
Stio palndromico:
Sequncia de DNA na qual a leitura da
fita direta (5-3) igual leitura da fita
reversa (3-5).
Enzimas de Restrio
Cortes possveis no DNA:
Vetores de Clonagem
So
ferramentas
utilizadas
para
promover a transferncia de material
gentico para uma clula hospedeira.
Tipos:
Plasmdeos: clonar fragmentos de at 9 kb.
Bacterifagos: clonar fragmentos de 9kb a
25 kb.
Cosmdeos: clonar fragmentos de 25 a 35
kb.
Plasmdeos
Molculas de DNA circular, fita dupla,
extracromossomais,
que
ocorrem
naturalmente em bactrias e algumas
leveduras.
Replicao independente que utiliza a mesma
maquinaria celular que realiza a replicao
cromossmica;
Geralmente
tem
grande
nmero
de
cpias/clula;
capaz de ser transmitido para as clulasfilhas.
Plasmdeos
Caractersticas:
Origem de replicao autnoma (ori):
Permite a replicao independente;
Plasmdeos
Caractersticas:
Regio promotora:
Promove a expresso do gene de interesse.
Pode ser induzido por agentes externos
Screening:
Deteco da presena do DNA de interesse;
Anlise fenotpica. Ex.: colorao
(azul/branco)
Sequncia lacZda -galactosidase
Colnias brancas so clones bem sucedidos!
Plasmdeos
Esquema bsico de clonagem:
Clonagem Molecular
o isolamento e a propagao em
um
organismo
de
molculas
idnticas de DNA
Organismo Recombinante
Extrao de DNA;
PCR
Digesto
Purificao
Tecnologia do DNA
recombinante
Uso de PCR (reao em cadeia da
polimerase):
Amplificao do gene de interesse
Formao de material para a utilizao
nos processos de clonagem.
Eletroferese de DNA
Objetivo:
identificar
e
separar
fragmentos de DNA por tamanho a
partir do padro de migrao em
uma matriz.
Anlise via UV
Preparao do vetor de
clonagem
Ligao do inserto no
plasmdeo
Uso de DNA ligase
Extremidades
coesivas
Transformao bacteriana
Choque trmico:
Transformao bacteriana
Eletroporao:
Construo do DNA
recombinante
Molcula de DNA de
um plasmdeo
circular
Molcula de DNA de um
plasmdeo linear com
extremidades coesivas
anelamento
Clivagem com
enzima de
restrio
Ligao covalente
pela DNA ligase
Insero em
uma clula
hospedeira
Molcula de DNA
plasmidial
contendo o
inserto
Expresso de Protenas
Recombinantes
Transformao
da E. coli
Cultura de
Clulas
Purificao
da Protena
Vacinas recombinantes
PRIMER F
1. PCR
Xb a
Primer R
I (4 )
Bam
LipL32 0906
HI (342)
Hin dIII (7 6 1)
lipL32
7 68 bp
L. interrogans
lipL32
2. Clonagens
pAE
3.
Multiplicao
pTARGET
E.coli (BL21)
Vetor
Plasmidia
l
Vetor
Plasmidi
al
pUS973
pUS974
pUS977
Vetor
Plasmidi
al
E.coli TOP10
Vetor
Plasmidia
l
Vetor
Plasmidia
l
Vetor
Plasmidia
l
Vetor
Plasmidi
al
E.coli TOP10
Vetor
Plasmidia
l
Vetor
Plasmidi
al
Vetor
Plasmidia
l
Vetor
Plasmidia
l
Vetor
Plasmidi
al
4. Vacinao
Vetor
Plasmi
dial
Vetor
Plasmi
dial
Vetor
Plasmid
ial
Protena
Recombinante
Vacina de DNA
Vetor
Plasmid
ial
Vetor
Plasmi
dial
Vetor
Plasmi
dial
Vetor
Plasmi
dial
Vetor
Plasmi
dial
Vetor
Plasmid
ial
Vetor
Plasmi
dial
Vetor
Plasmi
dial
Vetor
Plasmi
dial
BCGr
Vetor
Plasmidi
al
Vetor
Plasmidia
l
Vetor
Plasmidia
l
Animais transgnicos
Plantas transgnicas
Anticorpos
Definio:
Glicoprotenas solveis produzidas por linfcitos B e
clulas plasmticas aps a estimulao por uma
macromolcula (antgeno).
Pertencem a um grupo de grandes polipeptdeos
chamados imunoglobulinas.
Funes:
Capacidade de se ligar ao antgeno atravs de foras
no covalentes (ligaes de hidrognio, atrao
eletrosttica e fora de van der Waals)
Estrutura:
Molcula com uma forma semelhante letra Y
Anticorpos e Biotecnologia
Produo de anticorpos: sensibilizao com
antgenos puros ou parcialmente purificados.
Anticorpos monoclonais:
Provenientes de clones de um determinado Linfcito B;
Se ligam somente um epitopo no antgeno;
Soluo especfica um determinado epitopo;
Anticorpos policlonais:
Mistura de anticorpos contra vrios epitopos;
Soluo inespecfica (ligantes em vrios epitopos)
Anticorpos conjugados/marcados:
Ligao covalente de marcadores molcula de anticorpo
por meio de Engenharia gentica.
Anticorpos Policlonais
Anticorpos provenientes de diferentes clones
de linfcitos B ativados pelo mesmo antigeno.
A injeo de anticorpos policlonais sob a forma
de vacinas, estimula o desenvolvimento de
vrias
populaes
de
linfcitos,
no
concentrando o esforo na produo do
anticorpo mais adequado e mais eficiente o
que leva a uma diminuio da sensibilidade e
eficincia da resposta imunitria;
Esta eficincia foi conseguida com a produo
de anticorpos monoclonais.
Anticorpos Monoclonais
Anticorpos Monoclonais
Vantagens:
No precisam ser purificados;
So especficos para um determinado eptopo.
Mielomas:
Clulas hbridas que resultam da fuso de um linfcito
B com um mieloma;
Clulas imortais com capacidade de produo de
anticorpos em grande quantidade
Formam culturas celulares permanentes (conferida
pelo mieloma);
Produzem anticorpos especficos para um s tipo de
antignio (conferido pelo linfcito B).
Anticorpos Monoclonais
Verificao da compatibilidade de tecidos e rgos para
transplantes e enxertos;
Combate rejeio de rgos:
Anticorpos monoclonais ligam-se aos receptores membranares
das clulas T, impedindo que estes detectem o rgo
transplantado;
Diminuio das defesas do organismo, para evitar uma rejeio
(pode provocar outras patologias)
para deteco de
Anticorpos Monoclonais
Anticorpos monoclonais utilizados no tratamento de
carcinomas;
Imunotoxinas:
reconhecem
determinadas
molculas
presentes em clulas cancerosas, provocam a sua
destruio sem afetar as restantes clulas.
Terapias
Frmacos produzidos em grande
escala e com recurso biotecnologia:
Antibiticos
Vitaminas
Biomateriais
Esterides
Biomedicamentos
Hormnios
Vacinas
Bioconverso/Biotransforma
o
A produo de molculas e
substncias feitas industrialmente.
Etapas:
Preparao do material;
Bioconverso;
Recuperao do produto
Exemplos:
Fermentao