UNIVERSIDAD TCNICA DE AMBATO

FACULTAD DE CIENCIA E INGENIERA

EN ALIMENTOS
CARRERA DE INGENIERA BIOQUMICA

Ingeniera Gentica

Metodologa para a extraccin,

purificacin y
amplificacin del gen del alfa-1-antitripsina de
una protena de origen animal
Grupo de Trabajo
Octavo Bioqumica

EXTRACCIN

RUPTURA CELULAR
La fragmentacin
mecnica se obtiene
triturando la muestra
original puede ser de
hgado.
Se debe utilizar una
disolucin amortiguadora
de pH para obtener
fragmentos tisulares
pequeos
Luego se centrifuga y se
lava con agua estril
retirando el sobrenadante

RUPTURA CELULAR
Posteriormente se realiza la degradacin qumica de
la membrana citoplasmtica aplicando una solucin
de detergente SDS,
Se puede utilizar EDTA el cual desestabiliza la
adhesin entre clulas y con la matriz extracelular.
Las protenas de la matriz se pueden digerir con
proteinasas K que degradan ADNasa y ARNasa para
proteger al ADN de degradacin.

SEPARACIN DE ADN
Para la extraccin de ADN se
aade una mezcla 1:1 (v/v)
de fenol: cloroformo
Se centrifuga con lo cual se
logra separacin de fases en
la fase acuosa ADN, ARN y
glcidos
Quedan los lpidos de la
membrana. Se extrae el
sobrenadante en el cual est
el ADN

PURIFICACIN

PURIFICACIN

Se aade a la
fase acuosa
alcohol
absoluto o
isopropanol

Se somete a
centrifugacin
para que se
separe el ADN
que queda al
fondo del tubo

Se retira el
resto de agua,
y se hace
evaporar
restos de
alcohol.

Se conserva el
ADN a 4C en
disolucin de
agua
congelndolo.

AMPLIFICACIN

AMPLIFICACIN
Materiales
Para la amplificacin se utiliza como mejor mtodo
el PCR, en la que interviene un termociclador
La muestra pura que se obtuvo, debe tener la
siguiente adicin de reactivos. Se debe mezclar la
cantidad de reactivos necesarios, dependiendo la
proporcin que se desea amplificar

AMPLIFICACIN
Materiales
Los 4 dNTPs, en exceso, como sustratos para la sntesis de las
innumerables copias.
Para ser reconocidos los dNTPs deben ir acompaado con una
porcin de Mg2+.
Dos oligonucleticos de cadena sencilla, sus secuencias deben
ser complementarias a los extremos 3 de la regin de inters
anterior a amplificar
La adicin de una polimerasa Termoestable. Se adiciona una Taq.
Polimerasa la cual es resistente a la variacin de temperatura
que se produce en el termociclador.

Nmero de copias de la seccin del gen

Para
tener un nmero de copias aceptables

se le programa al termociclador con un

nmero de ciclos de 30, que nos permitira
tener un nmero exacto de:

Tendremos un nmero de copias al final de

los 30 ciclos en el termociclador de la
seccin de gen amplificado de:

HIBRIDACIN
Para esta etapa de la amplificacin se requieren de
cebadores o primers ,los cuales son diseados
previamente para que reaccionen con la hebra sencilla del
DNA
stos se pegan en lugares especficos por
complementariedad de bases para que la polimerasa los
extienda entre el espacio comprendido entre ambos
primers colocando dNTPs de 5a 3 leyendo el DNA de 3a
5.
De este modo se sintetiza la secuencia complementaria de
las hebras del DNA.

HIBRIDACIN
Para la eleccin del primers se elige una secuencia
altamente conservada que varen entre 15 y 30 pb
Los primers ms cortos pueden no proporcionar una
alta especificidad
Los primers ms largos son ms caros de sintetizar.
La longitud del primer es la suma de la regin
especifica ms la de los nucletidos no especficos
o zonas de reconocimiento.

HIBRIDACIN
Se debe evitar las repeticiones largas del mismo
nucletido ya que pueden disminuir la especificidad.
El contenido de G+C de los primers debe aproximarse o
superar ligeramente al contenido de G+C de la regin a
amplificar ya que pueden no competir efectivamente por
la unin originando un bajo rendimiento.
El primer usado en lo posible deben terminar en T 3 ya
que son ms tolerantes a la incorporacin de errores.