INTRODUCCIN

1. Ley de Lambert-Beer
2. Determinacin de protenas
1.
2.
3.
4.
5.

Absorbancia 280
Biuret
Lowry
Bradford
BCA

PARTE II: REVISIN DE MTODOS

ESPECTROSCPICOS Y ELABORACIN
DE CURVA ESTNDAR DE PROTENA
Objetivos

Aplicar un mtodo espectrofotomtrico para medir

la concentracin de una protena.
Conocer
el
manejo
de
micropipetas
y
espectrofotmetros.
Construir curvas de calibracin y comprender su
importancia.
Determinar el intervalo de sensibilidad de una curva
estndar.

ESPECTROFOTOMETRA

Definicin
Medicin de la cantidad de energa radiante
que absorbe un sistema qumico en funcin
de la longitud de onda de la radiacin.

El espectrofotmetro es un instrumento
que permite relacionar la radiacin
absorbida o transmitida por las molculas
en una solucin cuya concentracin es
desconocida con una que contiene una
cantidad conocida de molculas

ESPECTROFOTMETRO

Ley de Lambert - Beer

Relaciona la absorcin de luz

con las propiedades del
material atravesado.

LEY DE LAMBERT Y BEER

La ley explica que hay una relacin entre la

absorcin de luz por una sustancia y la
concentracin de sta, as como tambin con
la longitud del cuerpo que la luz atraviesa.

A = cl
Donde: A = absorbancia;
= Coeficiente de extincin molar;
l = longitud de la celda.

COEFICIENTE DE
EXTINCIN MOLAR

Es una medida de la cantidad de luz

absorbida por unidad de concentracin.

Un compuesto con un alto valor de

coeficiente de extincin molar es muy
eficiente para absorber luz a una cierta
longitud de onda y, por lo tanto, puede
detectarse al medir la absorcin en
soluciones muy diluidas.

Curva Patrn

Es un marco de referencia que se

construye a partir de cantidades conocidas
de una sustancia en solucin:
por ejemplo la albmina srica bovina en
agua

Limitaciones de L-B
Linearidad limitada por factores qumicos e instrumentales:

Desviacin del coeficiente de absortividad a altas

concentraciones (>0.01M) por interacciones
electrostticas
Difusin de la refleccin por partculas suspendidas
Fluorescencia o fosforescencia de la muestra
Cambios en ndice refractivo a altas concentraciones
Cambios en el equilibrio qumico por alta concentracin
Radiacin no monocromtica

Limitaciones de L-B

DETERMINACIN DE
PROTENAS
Comparacin de mtodos

Cuantificacin de Protenas

A)

B)
C)

Determinar la concentracin de protenas en

una muestra biolgica es una tcnica de
rutina bsica cuando se aborda un esquema
de purificacin de una protena concreta:
cuando se quiere conocer la actividad
especfica de una preparacin enzimtica,
para el diagnstico de enfermedades,
as como para otros muchos propsitos.

Cuantificacin de Protenas

a)
b)
c)

Existen diferentes mtodos para la

cuantificacin de protenas. Muchos de
estos mtodos se basan en:
la propiedad intrnseca de las protenas
para absorber luz en el UV,
para la formacin de derivados qumicos, o
la capacidad que tienen las protenas de
unir ciertos colorantes.

PROTENAS y la absorcin en la
regin UV

Las bandas de absorcin ms

significativas se encuentra en el
ultravioleta cercano, en el intervalo de
longitud de onda entre 230 y 300 nm.

Aminocidos
aromticos,
histidina y la cistina.

La cistina presenta
centrada a 250 nm.

una

la
banda

Clculo para obtener la

concentracin de protena

Coeficiente de extincin molar del BSA es 43,824 M-1cm-1

o bien

Coeficiente de extincin molar del BSA 6.6 para una solucin de

BSA 1% (10mg/mL)

REACCIN DE BIURET

La reaccin debe su nombre

al Biuret, una molcula
formada a partir de dos
molculas de urea
(H2N-CO-NH-CO-NH2).
Complejo con Cu2+

MTODO DE LOWRY

Reaccin de determinacin de protenas

en dos pasos:

1.

Reaccin de Biuret.
La reduccin, tambin en medio bsico,
del reactivo de Folin-Ciocalteau por los
grupos fenlicos de los residuos de
tirosina.

2.

PRIMER PASO
Enlaces peptdicos

Reaccin de
Cu2+ en medio
alcalino

SEGUNDO PASO
tirosina, triptfano, y
en menor grado por cistena,
cistina e histidina.

Reaccin con el
Folin-Cicalteau

LOWRY

LOWRY

Tincin de protenas con Azul

de Coomasie

Ensayo en tubo del mtodo de Bradford. Hacer

curva patrn

Tincin de protenas en gel de poliacrilamidaSDS

BRADFORD
Se basa en la unin de un colorante, Comassie Blue

G-250 (tambin Serva Blue) a las protenas.

El colorante, en solucin cida, existe en dos formas
una azul y otra naranja.
Las protenas se unen a la forma azul para formar un
complejo protena-colorante con un coeficiente de
extincin mayor que el colorante libre.
Este mtodo es sensible (1-15 g), simple, rpido,
barato y pocas sustancias interfieren en su
determinacin.
Entre las sustancias que interfieren estn los
detergentes y las soluciones bsicas.

EL AZUL DE COOMASIE Y LOS

AMINOCIDOS QUE RECONOCE

CAMBIO DE ABSORBANCIA
DEL AZUL DE COOMASIE
Coomasie libre
(catinico)

Coomasie-protena
(aninico)

BRADFORD

BCA

BCA
Combina la reduccin de Cu2+ a Cu1+ por la portena en medio alcalino
con la deteccin del catin cuproso (Cu1+) por el cido bicinchonnico
(Rxn de Biuret).
Primer paso: quelacin de cobre por la protena en medio alcalino. Los
pptidos que contienen tres o ms residuos de aa forman un complejo
quelado con el cobre y tartrato de sodio.
Segundo paso: BCA reacciona con (Cu1+). Dos molculas de BCA por in
cuproso. Desarrollo de color prpura. Lectura a 562 nm.
Formacin de color influenciado por cistena, cistina, tirosina y triptfano.
A diferencia de mtodos con Coomasie (Bradford) el esqueleto peptdico
tambin contribuye a la formacin de color, disminuyendo la variablidad.

Cuadro comparativo de sensibilidad de las

tcnicas de cuantificacin de Protenas

El experimento

Micropipetas

Micropipetas

TIPOS DE MICROPIPETAS
Los tipos: P1000, P200, y P20.
P1000 es til para volmenes de 200 hasta 1000 L
P200 es til para volmenes de 20 hasta 200 L.
P20 es til para volmenes de 0.5 hasta 20 L.

No Trate de colocar la micropipeta para volmenes mayores que el mximo, o para

volmenes menores del cero, esto descalibrar y daar la micropipeta.
Toda micropipeta utiliza puntas desechables (no utilice la pipeta sin usar la punta
apropiada, hacer esto contaminar la micropipeta y la puede daar).
No utilizar la micropipeta con lquidos que atacan el polipropileno.
No utilizar lquidos que estn emitiendo vapores.
La temperatura de los lquidos debe estar entre 15 y 40 C.
Al poner la punta, asegrese que la punta sea del tipo correcto y que esta
correctamente ajustada.
Generalmente para P1000 las puntas son azules, para P200 son amarillas y para
P20 pueden ser amarillas o blancas.