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Espectrofotome
tra
de
fluorescencia
LUMINISCENCIA MOLECULAR
I. Fluorescencia
Foton
II. Fosforescencia es
III. Quimioluminiscencia
Rx.
Fluorescencia
Excitado
1
Fundame
ntal
1 2
=
Fluorescen
cia de
resonancia
Fluorescencia
Excitado
1
Fundame
ntal
1 2
<
Desplazami
ento de
Stokes
Singulete
Fundame
ntal
Singul
ete
Excita
do
Triplet
e
Excita
do
FOSFORESCENC
FLUORESCEN
CIA
IA
Procesos de desactivacin
Relajacin vibracional
D
q
D
q
D
A
q
D
D
D
Procesos de desactivacin
Conversin interna
Excitado
2
-E
Excitado
1
Niveles
energticos
prximos
Solapamiento
niveles
vibracionales
Procesos de desactivacin
Conversin interna
Conversin interna
predisociacin
Excitado
2
Energa
equivalente a
enlace dbil
Excitado
1
Procesos de desactivacin
Conversin interna
vibracional
Relajacin
Excitado
2
Excitado
1
Fundame
ntal
Procesos de desactivacin
Conversin interna
vibracional
Relajacin
Procesos de desactivacin
Cruce entre sistemas
Singulete
*
Triplete*
Br, I, O 2
lo
favorecen
Rendimiento (o eficiencia)
cuntico(a) =
fotones
= fluorescentes
fotones totales
absorbidos
Estructur
Ambient
a
TRANSICIONES
ELECTRNICAS
E
Singulete*/Trip
lete*
1000
100 X
*
t1/2 10-9 10-7 s
X*
t1/2 10-7 10-5
s
ESTRUCTURA,
condensacin anillos
Piridina
Furano
Quinolina
Indol
Tiofeno
ESTRUCTURA, sustituyentes
n - * < *
Tomado de Skoog y
ESTRUCTURA, rigidez
1.0
0.2
Conversi
n
interna
DISOLVENT
E
CH3CH2 - I
pH,
resonancia
Sustituyentes cidos (o
bsicos), estado inico =
CONCENTRACI
N
A
q
A
q
A
A
A
A
q
A
q
autoamortigua
CONCENTRACI
N
A
autoabsorcin
emis =
cte.
RFU
Intensidad
ESPECTROS EXCITACIN Y
EMISIN
exc
Grfica A. Espectro
de excitacin
exc =
cte.
emi
Grfica B. Espectro
de emisin s
ESPECTROS EXCITACIN Y
EMISIN
ESPECTROS EXCITACIN Y
EMISIN
Instrumentaci
n fluorometra
ESPECTROFLUORMETRO
Monocroma
dor de
excitacin
Monocroma
dor de
emisin
aplicacion
es
ANLISIS CUANTITATIVO
OH
OH
N=N
Al, F-
Zr y Sn
SO3N
a
Granate de alizarina R
Riboflavina (vit
B2)
ANLISIS CUANTITATIVO
ADRENALIN
A
ANLISIS CUANTITATIVO
Ejemplo: 1 muestra de 1 g de cereal se trat
con cido y una pequea cantidad de KMnO4
para oxidar la riboflavina (Rb) presente. El
exceso de KMnO4 fue eliminado con H2O2.
La disolucin anterior se transfiri a un
matraz de 50 mL y se diluy hasta la marca.
Una alcuota de 25 mL de esta disolucin se
transfiri a una celda, se agreg una pequea
cantidad de ditionita de sodio para convertir
la Rb-oxidada a Rb y se ley la fluorescencia
relativa, en un equipo previamente ajustado
ANLISIS CUANTITATIVO
Ejemplo 2: una pastilla antimalaria es
analizada
para
determinar
la
concentracin
de
quinina.
Para
tal
propsito una tableta de 1.644 g se
disuelve en HCl 0.1 M en un matraz
volumtrico de 500 mL.
Con una pipeta se transfieren 15 mL de la
disolucin anterior a un matraz aforado de
100 mL, y se diluyen con cido hasta la
marca.
ANLISIS CUALITATIVO
Fluorocromo: marcador colorante
con capacidad de fluorescer al ser
excitado a una en particular.
Fluorforo:
grupo funcional de
una molcula (fluorocromo) que le
imparte
la
propiedad
de
fluorescencia.
http://www.medic.ula.ve/histologia/anexos/microscopweb/MO
NOWEB/capitulo6
ANLISIS CUALITATIVO
http://www.medic.ula.ve/histologia/anexos/microscopweb/MO
NOWEB/capitulo6
ANLISIS CUALITATIVO
Microscopia de fluorescencia
DAPI: azul
GFP: verde
RODAMINA:
rojoII.
Fig.
Clula en
Procesos celulares
Expresin gnica
cDNA =
Texas-red
Genoma =
FITC
FOSFORESCEN
CIA
FOSFORESCENCIA
Procesos de desactivacin. Cruce
entre sistemas
Fosforescencia, caractersticas
Probabilid
ad
Singulet
e*
Triplete*
t1/2 10-4
10s
Requiere
:
T
viscosidad
Quimioluminiscencia
Luminol
(qumica
forense)
Deteccin de
restos de
sangre
Quimioluminiscencia
Rx
qumic
a
energa
luz
Analito
Quimioluminiscencia
Determinacin N
orgnico:
1100 C
muestra
NO +
O3
LUZ
+
NO2
Quimioluminiscencia
+
NO
CO2
-
CO2
-
catalizad
or
N2
+
luz