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Microscopa de

Contraste
de

Fases

GENERALIDADES
La
microscopa de contraste de fase, fue
desarrollada fundamentalmente por Zernike en
1932.
Se basa fundamentalmente en el retraso que se
produce en las ondas de luz al atravesar objetos
de distintos ndices de refraccin, aprovechando y
amplificando dichos retrasos.
Es un microscopio ptico modificado que permite
contrastar sustancias de diferente grosor o
densidad.
Mediante un condensador y un objetivo especial
se controla la iluminacin de tal manera que vaya
en diferentes rutas a travs de las distintas partes
de una clula.
El resultado es una imagen con diferentes grados
de brillo y oscuridad.
Se utiliza para visualizar estructuras celulares sin
necesidad
de
usar
colorantes
o
matar

Principio de la Microscopa de
Contrastes
Se basa en el hecho de que cuando interfieren
ondas que tienen un determinado desfase se
produce una interferencia constructiva (con mayor
amplitud) o destructiva (con menor amplitud).

Objetivo de la Microscopa de
Contrastes
El objetivo es manipular el desfase de dos haces de
luz para trasladar esas pequeas variaciones de
fase a los correspondientes cambios de amplitud
que se visualizan como diferencias de contraste.

Pequeas diferencias de fase se convierten en


cambios de intensidad.

Constitucin del Microscopio de Contraste


deFase

El Microscopio de Contraste de Fases Contiene:


Diafragma anular en el Condensador que consta de un
anillo transparente con la parte central oscurecida y que
forma un cono de luz hueco como el del microscopio de
campo oscuro.
El condensador presenta un disco que proyecta un haz de
luz con forma anular, y en la lente de salida de los objetivos,
se agregan unos anillos de fase, que son discos
transparentes con un diseo en relieve, cabe destacar que
existen dos tipos diferentes de anillos de fase, denominados
positivo y negativo, los cuales tienen distintos efectos sobre
la luz y por lo tanto, las imgenes se ven diferentes en cada
uno, esto se explicar ms adelante.

Constitucin del Microscopio de Contraste


deFase

Placa de Difraccin
Placa de Fase
dentro del tubo del sistema de lentes objetivos,
la cual consta de un anillo ranurado a manera
de disco.
Ocular similar al del microscopio de campo
claro.

TIPOS DE MICROSCPIOS DE CONTRASTE DE


FASES

Contraste de fase oscuro o


positivo:cuando los rayos de luz, la desviada
y la no desviada tienden a cancelarse creando
una interferencia destructiva y hacer que el
objeto aparezca mucho ms oscuro que los
alrededores.
Contraste de fase brillante o
negativo:se presenta cuando retrasamos la
luz no desviada y la hacemos 1/4 de longitud
de onda menor, lo que hace que salga al
tiempo con la luz desviada, que tiene un
retraso de 1/4 de longitud de onda, logrando
de esta manera que salgan al mismo tiempo
y se recombinen


FORMACIN DE LA IMAGEN

El primer paso es separar la luz directa de


la luz difractada. Para ello se coloca, en el
plano focal de la condensadora, un
diafragma anular que proyecta en el
infinito la imagen de un haz anular.
Este cono de luz hueco pasa a travs de la
muestra sin desviarse y la dbil luz
difractada por la muestra se extiende en
todo el plano focal posterior del objetivo.


AJUSTE DEL
MICROSCOPIO
La correspondencia entre las placas de fase de los
objetivos y los diafragmas anulares de la condensadora ha
de ser exacta. A cada placa le corresponde un diafragma
anular y el centrado de ambos ha de ser exacto.

El centrado se realiza con una lente de Bertrand que


permite enfocar el diafragma anular del condensador
La iluminacin de Khler debe estar ajustada y el
diafragma de apertura completamente abierto para
trabajar en modo contraste de fases.
Para centrar las placas con el diafragma anular se inserta
la lente de Bertrand y se enfoca. Se gira el disco de la
condensadora para insertar el diafragma anular que
corresponda y se hacen coincidir con unos tornillos de
ajuste


AJUSTE DEL
MICROSCOPIO

En el ao 1893, el profesor August Khler propuso un mtodo de


iluminacin para optimizar la observacin microscpica y la
microfotografa, que permite aprovechar al mximo las
capacidades de las lentes (objetivos) iluminando la muestra en
estudio con un campo de luz uniforme cuyo dimetro sea igual al
del rea de captura del objetivo. Los microscopios modernos estn
diseados para aplicar la iluminacin Khler y los requerimientos
son (figs. 4-12 y 4-13):
Condensador que sube y baja para enfocar el cono de luz.
Bombilla con lente colectora.
Dos diafragmas, un diafragma de campo situado a nivel de la
lmpara y un diafragma de apertura, colocado debajo del
condensador.


AJUSTE DEL
MICROSCOPIO

Iluminacin Khler. Se debe iluminar el espcimen siguiendo el


esquema. La lmpara posee un filamento (S) incandescente
cuya luz es captada por la lente colectora L1 y regulada por el
diafragma de campo D1. La imagen S del filamento de la
lmpara es proyectada al plano del segundo diafragma D2. Este
primer paso se realiza con D1 completamente abierto. La altura
del condensador L2 se regula de manera que su punto focal est
en el plano D2. La imagen del diafragma de campo D1 es
proyectada en el plano de la preparacin por el condensador


AJUSTE DEL
MICROSCOPIO

Existen dos tipos de iluminacin Khler:


Un mtodo en el cual la luz es transmitida a
travs del espcimen (transmitida).
Otro mtodo cuando la luz es reflejada desde
el espcimen (incidente).
La iluminacin Khler transmitida es usada
para
especimenes
transparentes
o
semitransparentes.
La iluminacin Khler incidente es til para
objetivos como el metal, los cuales no
transmiten luz


AJUSTE DEL
MICROSCOPIO
La
luz
incidente
atraviesa
un
diafragma anular, y la lente del
condensador focaliza un anillo circular
de luz sobre la muestra. La luz que
pasa sin obstculos a travs de la
muestra es focalizada por el objetivo
sobre el grueso anillo gris de la placa
de fase, que absorbe parte de la luz
directa y altera su fase en un cuarto
de longitud de onda. Si una muestra
refracta difracta la luz, se altera la
fase de algunas ondas lluminosas y
stas se redirigen a travs de la
delgada regin clara de la placa de
fase. Se recombinan las luces
refractada y no refractada en el plano
de la imagen para formar la imagen.


AJUSTE DEL
MICROSCOPIO

Pasos para el ajuste de iluminacin Khler:


1.- Enfoca el especimen.
2.- Con el diafragma completamente cerrado localizado lo ms cerca
del origen de luz (campo iris) de manera que puedas ver los lmites
del diafragma.
3.- Trae los mrgenes del campo iris a enfoque aumentando o
disminuyendo el enfoque con la arueda del condensador. Tanto el
especimen como el iris deben estar en foco.
4.- Centra la imagen del campo iris usando las ruedas de
condensador-centrador.
5.- Abre el centrado y enfoca el campo iriso de maneras que los
mrgenes del campo iris estn ms all del campo de visin.
6.- Ajusta el condensador iris para incrementar o disminuir el
contraste de la imagen. La apertura ptima depende del especimen.
Nunca uses esta apertura para controlar la intensidad de luz.
7.- Ajusta la intensidad de luz con el potencimetro o con filtros de
densidad neutra (para fotografa en color).


TRAYECTORIA DE LA LUZ EN L MICROSCOPIO DE
FASES


LIMITACIONES

Las imgenes presentan halos alrededor de los detalles.


Puede empeorar la resolucin.
No funciona bien con muestras gruesas porque los
desplazamientos de fase ocurren en reas ligeramente por
debajo o por encima del plano de foco.
Estos desplazamientos pueden confundir y distorsionar
los detalles de la imagen.


Se puede convertir el microscopio normal en
uno de contraste de fases?

Para convertir un microscopio convencional en


uno de contraste de fases se sustituye el
condensador y el objetivo por los de contraste
de fases, los cuales contienen un filtro en
anillo y una placa de fases respectivamente
Los objetivos de contraste de fases se
identifican por sus letras verdes y la indicacin
del tamao del anillo de fases (Ph1, Ph2, Ph3 o
PhC, PhL, PhP)