Universidad Autnoma de Sinaloa

Facultad de Ciencias Qumico Biolgicas

Licenciatura en Ingeniera Bioqumica

T E S I S:

Aprovechamiento del Subproducto Agroindustrial Melaza

para la Produccin de Bioetanol mediante Cultivo
Sumergido de Saccharomyces cerevisiae
Que presenta
Gilberto Rafael Vargas Luna
Como requisito para obtener el ttulo de
Licenciado en Ingeniera Bioqumica
Directores de tesis
Dr. Oscar M. Hernndez Caldern
Dra. Erika Yudit Ros Iribe
Culiacn, Sinaloa, Mxico, de 2015

AGOTAMIENTO DE COMBUSTIBLES FOSILES

Investigacin y Desarrollo Tecnolgico
Implementada en una regin
sobreproductora de biomasa

MELAZA

El etanol ha sido obtenido por

fermentacin de diversos sustratos

Industria agro-azucarera
BIOETANOL

Lder en el sector
primario agrcola
S. cerevisiae

Microorganismos responsables en
la fermentacin

Sustratos de alto inters para la

BIODISEL
obtencin de alcohol

Z. mobilis
Gnecco, 2004; Vzquez y Dacosta, 2007

Biocombustibles
Ley de Promocin y Desarrollo de los Biocombustibles

Combustibles obtenidos de la biomasa provenientes de materia

orgnica de las actividades, agrcola, pecuaria, silvcola, acuacultura,
algacultura, residuos de la pesca, domsticas, comerciales,
industriales, de microorganismos, y de enzimas, as como sus
derivados, producidos por procesos tecnolgicos sustentables que
cumplan con las especificaciones y normas de calidad establecidas por
la autoridad.

(Oliva, 2003; SAGARPA, 2011)

Los

Tipos
de
biocombustibles
carburantes
renovables
son
productos

fabricados a partir de combustibles comunes, que

son transformados y preparados para que puedan
ser utilizados.
Biodiesel

Bioetanol

Biogs

(SAGARPA, 2011)

Situacin en Mxico de los

biocombustibles

2008

(SENER, 2006; IMP, 2009; Babethanol, 2010;

CIBNOR, 2010; CICY, 2010; IPN, 2010;
Rousseau, 2010; UAM, 2010)

Clasificacin de los biocombustibles

Primera generacin

Segunda generacin

Tercera generacin

(SAGARPA, 2011)

Bioetanol como combustible

Pureza del etanol
Aplicaciones mdicas
Bebidas alcohlicas
Biocombustible

96 %
99.5 % al
99.9 %

Empleado directamente o aadido a la

gasolina en distintas concentraciones
La mezcla ms comn
para oxigenar a la
gasolina

5%

Reemplazando
al oxigenante

Altamente
contaminante
del suelo y del
agua
subterrnea

(Ballesteros, 2001; Briceo y Calero, 2004;SAGARPA, 2011)

Proceso de Produccin de la Melaza

-Industria azucareraCaa de Azcar
Planta herbcea
plurianual.
Gnero: Saccharum
Produccin de azcar a
partir de su jugo

TIPOS DE MELAZA:
A (Primera etapa de cristalizacin y
centrifugacin)
B (sometida a nueva cristalizacin y
centrifugacin)
C (modo anlogo)

Aprovechamiento de la melaza de
caa
UTILIZACIN
Alimentos

GENERALIDADES
Propicia una alimentacin rica en hidratos de carbono
adems de vitaminas del grupo B y abundantes minerales.

Animales

Brinda una alimentacin ms rica y paliativa al ser mezclada

en: desecados de pulpas, mezcla con diversos alimentos,
pulverizado de forrajes, suplemento de ensilajes.

Vinazas para la obtencin de cido glutmico.

Recuperacin
de lquidos
Lejas finales como alimento animal y para la obtencin de
desazucarados aminocidos.
Levaduras para panificacin.

Fermentacin

Levaduras para alimentacin humana y animal: aditivo para

piensos, extractos e hidrolizados de levadura, fuente de
enzimas, vitaminas y cidos nuclecos. Adems es el
sustrato utilizado en la produccin de protena unicelular.
Grasas de levadura.
Alcohol etlico.

(Ariza y Gonzles, 1997)

Saccharomyces cerevisiae
Clasificacin taxonmica

Fcil manipulacin y de recuperacin

Econmico

Reino

Fungi

Divisin

Ascomycota

Clase

Hemiascomycetes

Tolera altas concentraciones de etanol

Orden

Saccharomycetales

Familia

Saccharomycetacea
e

Produce bajas concentraciones de

Gnero

Saccharomyces

Especie

cerevisiae

subproductos
Osmotolerante
Presenta alta viabilidad celular

Temperatura
ptima
de
crecimiento es de 25 a 30 C
Fermenta:
Glucosa, Galactosa, Sacarosa y Maltosa
No Fermenta:
Lactosa
Asimila: Rafinosa

En presencia de
oxgeno pueden
metabolizar
glicerol, etanol y
lactato

(Tuite y Oliver 1991;Yepez,

1995; Ariza y Gonzlez, 1997;
Fajardo y Sarmiento, 2007)

Proceso de cultivo microbiano

En ausencia de O2 = FERMENTACIN

Biomasa + Productos + CO2 + H2O

+ Calor

Ertola y col., 1995

Crecimiento Microbiano

Va de Embden-Meyerhof, secuencia de reacciones enzimticas en

la conversin de la glucosa a piruvato y despus a productos de
fermentacin.
Sacarosa
invertasa

Fructosa

11 Alcohol deshidrogenasa

(Halasz y Laszlity, 1991)

Produccin de Etanol

JUSTIFICACIN
Debido al agotamiento de los combustibles fsiles y el gran impacto
ambiental que estos ejercen, el desarrollo de la tecnologa de los
Biocombustibles busca, adems de solucionar el problema energtico
actual, un combustible renovable y con menor emisin de gases
contaminantes. Por ello, el bioetanol puede ser considerado un buen
recurso energtico potencialmente sostenible, de alta vialidad tcnica para
su produccin y que puede ofrecer ventajas tanto ambientales como
econmicas a largo plazo. La utilizacin de Bioetanol tambin podra
generar un gran impacto sobre el problema del cambio climtico y el
calentamiento global, ya que sta es una fuente energtica limpia y
renovable, que ayudara a reducir la emisin de los gases de efecto
invernadero.

HIPTESIS
El medio de cultivo a base de

melaza diluida y

complementada con fosfato de amonio es idneo para

producir un alto contenido de etanol utilizando cultivo
microbiano de Saccharomyces cerevisiae.

OBJETIVOS
Objetivos
Especficos
Objetivo General
Caracterizar la composicin de la melaza: contenido de
Determinar la tasa de dilucin de melaza en agua que
humedad, azcares totales, azcares reductores,
permite constituir, en conjunto con fosfato de amonio, un
slidos suspendidos, nitrgeno, fosfato y cenizas.
medio de cultivo idneo para producir un alto contenido
Determinar las cinticas de consumo de azcares
de etanol en un cultivo sumergido de Saccharomyces
totales, azcares reductores, nitrgeno y fosfato, y las
cerevisiae 424A (LNHST) a nivel matraz.
cinticas de produccin de biomasa y etanol para cada
tratamiento experimental.
Determinar la tasa de dilucin de melaza en agua que
maximiza la produccin de biomasa.
Determinar la tasa de dilucin de melaza en agua que
maximiza el contenido de etanol producido.

MATERIALES
Y
MTODOS

MATERIAL BIOLGICO
El
Estemicroorganismo
proyecto de investigacin
utiliz
utilizado fue
unamelaza
cepa
obtenida del Ingenio
en la
sobreproductora
de S.Eldorado,
cerevisiaesituado
424A (LNH
sindicatura
de Eldorado
de la ciudad
ST),
un cultivo
proporcionado
por de
el
Culiacn, Sinaloa;
de la cosecha
Laboratorio
de Biotecnologa
y 2013-2014.
Bioingeniera
del Instituto Tecnolgico de Celaya.

DESARROLLO EXPERIMENTAL
Propagacin de
Saccharomyces
cerevisiae

Fermentacin:
150 g L-1, 200 g L-1,
250 g L-1 y 300 g L-1
de melaza diluida

Muestreo,
preparacin de
muestras y anlisis

MEDIOS DE CULTIVO
Medio
Medio de
de fermentacin
propagacin
Compuesto
TRATAMIENTOS
Medios de Melaza

Extracto de
levadura

Cantidad (g)
10

150 g L-1 C H O (glucosa)

6 12 6
200 g L-1

NH4Cl

5 g L-1 de (NH4100
)H2PO4
2.5

2.91
250 g L-1 Na2HPO47H21Og L-1 de MgSO
47H2O

300 g L-1

Centrifugacin
por 30 min a
4000 rpm

KH2PO4

MgSO47H2O

0.25

CaCl2

0.08

C6H8O7H2O (cido
ctrico
monohidratado)

4.3
Se recolect el
medio y se
afor a 500 mL

C6H5Na3O7XH2O
(citrato de sodio
3
Los medios se esterilizaron en
tribsico
autoclave durante 15 min a 15 lbf/plg2
hidratado)
2
1992)
Los medios se esterilizaron en autoclave durante(Thatpamala
15 min a 15ylbcol.,
f/plg

CONDICIONES DE CULTIVO

Resuspencin de
levadura con 10
mL de NaCl (0.9
%)

Inoculacin con
8 mL en 250 mL
de medio de
propagacin
-28 C
-280 rpm
-16 horas

(Thatpamala y col., 1992)

Inoculacin en
una relacin del
10 % v/v inculo
respecto al
medio de cultivo

Fermentacin
-28 C
-150 rpm
-96 horas

MUESTREO

Inmediatamente:
Tratamiento y Anlisis

METODOLOGA APLICADA
Sobrenadante

Destilacin
Determinacin de
Bioetanol
(Sumbhate, 2012)

Filtracin
Membrana
0.45 m

Centrifugacin por
20 min a 3500 rpm

Determinacin de:
Azcares Totales
(Dubois y col., 1956)
Azcares Reductores
(Miller, 1959)
Nitrgeno
(Solrzano, 1969)
Fosfato (Jurez y
Rochn, 1966)

Determinacin
de Biomasa
(Ros-Iribe, 2011)

Determinacin de Etanol

0.4 mL de
destilado

15 mL de
filtrado

Destilacin

0.8 mL de Sln.
de Dicromato
de Potasio

10 mL de
destilado
10 min

585 nm

4 mL de
HO
destilada

(Sumbhate, 2012)

RESULTADOS Y
DISCUSIONES

Caracterizacin de la Melaza
Determinacin

Fernndez Lpez y col. (2012)

Humedad

21.84

Cenizas

6.43

Slidos en
suspensin

1.23

Azcares totales

57.81

Azcares reductores

26.01

Nitrgeno

0.0013

Fosfatos

0.1742

Medios de fermentacin

Cultivo de S. cerevisiae utilizando 150 g L-1 de melaza.

Azcares reductores

35.53 g L-1
(4.45 % v/v)

9.38 g L-1

80

60

40

20

24

48

72

-1

-1

100

Nitrgeno [ g L ] Fosfatos

Nitrgeno
Fosfatos

-1

10

Azcares totales

Azcares reductores [ g L ] Azcares totales

Produccin de biomasa [ g L ]

Producin de etanol [ %v/v ]

Biomasa
Etanol

96

Tiempo de fermentacin [ h ]

Cinticas de consumo de azcares totales, azcares reductores,

nitrgeno y fosfato, y produccin de biomasa y etanol

Cultivo de S. cerevisiae utilizando 200 g L-1 de melaza.

20

34.90 g L-1
(4.36 % v/v)

17.61 g L-1

80

14
12

60

10

40

6
4

20

2
0

-2
0

24

48

72

-1

-1

100

16

-1

Produccin de biomasa [ g L ]

Produccin de etanol [ %v/v ]

18

Nitrgeno
Fosfatos

Nitrgeno [ g L ] Fosfatos

Azcares totales
Azcares reductores

Azcares reductores [ g L ] Azcares totales

Biomasa
Etanol

Tiempo de fermentacin [ h ]

Cinticas de consumo de azcares totales, azcares reductores,

nitrgeno y fosfato, y produccin de biomasa y etanol

16

15.2 g L-1

140

12

120

10

100

-1

-1

Produccin de biomasa [ g L ]

Produccin de etanol [ %v/v ]

160

34.86 g L-1
(4.36 % v/v)

14
4

Nitrgeno
Fosfatos

80

60

40

20

24

48

72

-1

Azcares totales
Azcares reductores

Nitrgeno [ g L ] Fosfatos

Biomasa
Etanol

Azcares reductores [ g L ] Azcares totales

Cultivo de S. cerevisiae utilizando 250 g L-1 de melaza.

96

Tiempo de fermentacin [ h ]

Cinticas de consumo de azcares totales, azcares reductores,

nitrgeno y fosfato, y produccin de biomasa y etanol

30.2 g L-1
(3.79 % v/v)

200
180
160

14

140

12

120

-1

10

80

60

40

20

0
-20
0

24

48

72

96

-1

100

[gL ]

-1

Produccin de biomasa[ g L ]

Produccin de etanol [ % v/v ]

16

16.6 g L-1

Fosfatos

18

Nitrgeno

Nitrgeno
Fosfatos

Azcares totales
Azcares reductores

Etanol

Azcares reductores [ g L ]

Biomasa

Azcares totales

Cultivo de S. cerevisiae utilizando 300 g L-1 de melaza.

Tiempo de fermentacin [ h ]

Cinticas de consumo de azcares totales, azcares reductores,

nitrgeno y fosfato, y produccin de biomasa y etanol

Produccin de biomasa
Medio de 150 g L

-1

Medio de 200 g L

-1

Medio de 250 g L

-1

Medio de 300 g L

-1

20.0

-1

Produccin de biomasa [ g L ]

17.5
15.0
12.5
10.0
7.5
5.0
2.5
0.0

24

48

72

96

Tiempo de fermentacin [ h ]

Cinticas de produccin de biomasa empleando diferentes

concentraciones de melaza

Consumo de azcares
-1

200
180
80

Echegaray y col. (2000)

Las altas concentraciones de
melaza favorecen la acumulacin
de sustrato residual en cultivos
continuos o fed-batch.

160
-1

Azcares totales [ g L ]-1

Azcares reductores [ g L ]

-1

Medio de 150 g L
Medio de 200 g L
-1
-1
Medio de 250 g L
Medio
de 300 g L
-1
-1
Medio de 150 gL
Medio de 200 gL
-1
-1
Medio de 250 gL
Medio de 300 gL

140
60
120
100
40
80
60
20
40
20
00
-20
00

24
24

48
48

72
72

96
96

Tiempo
Tiempo de
de fermentacin
fermentacin [[ h
h ]]

Cinticas
dede
consumo
dede
azcares
reductores
empleando
diferentes
Cinticas
consumo
azcares
totales empleando
diferentes
concentraciones de melaza

Produccin de bioetanol
-1

-1

Medio de 150 g L
-1
Medio de 250 g L

Medio de 200 g L
-1
Medio de 300 g L

Produccin de etanol [ % v/v ]

24

48

72

96

Tiempo de fermentacin [ h ]

Cinticas de produccin de etanol empleando diferentes

concentraciones de melaza

Anlisis de varianza
Fuente de
variacin

Suma de
Cuadrados

Grados de
Libertad

Cuadrado
Media

4.12683

1.37561

48.3224

52

0.929277

52.4493

55

Entre
grupos

Dentro de
los grupos

Total
(Corregido)

H0 = 1 = 2 = 3 = 4
H1 2 3 4

SE ACEPTA

Razn-F

Valor-P

1.48

0.2307

Comparacin de la produccin de bioetanol

-1

-1

Medio de 150 g L
-1
Medio de 250 g L

Medio de 200 g L
-1
Medio de 300 g L

Produccin de etanol [ % v/v ]

35.53 g L-1 (4.45 % v/v)

36 horas de fermentacin
Medio de 150 g L-1

24

48

72

96

Tiempo de fermentacin [ h ]

Investigacin

Produccin
de etanol

Siqueira y col.
(2008)
Lau y col. (2010)
Govindaswamy y
Vane (2007)

Pea y Arango
(2009)

Condiciones de fermentacin

37.8 g L
(4.7 % v/v)

Melaza de soya
S. cerevisiae (LPB-SC)
20 Brix
Sin adicin de MgSO4 y NH4NO3

46.9 g L-1
(5.9 % v/v)

Saccharomyces cerevisiae 424A (LNH-ST)

Fuente de nitrgeno licor de maz
100 g L-1 de xilosa

24 g L-1
(3 %v/v)

Saccharomyces cerevisiae 424A (LNH-ST)

60 horas de la fermentacin
20 g L-1 de glucosa y 40 g L-1 de xilosa

31 g L-1
(3.9 % v/v)

Cepas recombinantes de S. cerevisiae

250 g L-1 de sacarosa de melaza de caa

39.89 g L-1
(5 % v/v)

Cepas recombinantes de S. cerevisiae

Medio sinttico YPS
250 g L-1 de sacarosa

-1

CONCLUSIONES

No existen diferencias significativas entre los tratamientos para

la produccin de bioetanol en los distintos medios de cultivo a
base de melaza de caa, bajo las condiciones de estudio.

La mayor concentracin de etanol se gener en el medio de 150

g L-1 de melaza (4.45 % v/v de etanol), a las 36 horas de cultivo.

Las altas concentraciones de sustrato melaza de caa no

inhiben el crecimiento y la produccin de etanol, debido a que S.
cerevisiae soporta altas concentraciones de azcar durante su
crecimiento.

Con las concentraciones de melaza 250 y 300 g L-1 se obtuvieron

altas concentraciones de fuente de carbono al final del proceso
de fermentacin, por tanto, es mejor utilizar las menores
concentraciones de melaza y as disminuir el costo de sustrato
empleado.

La concentracin de fosfato de amonio utilizada fue muy elevada

ya que no se agot en ninguno de los tratamientos
implementados.

El fosfato es indispensable para la etapa de crecimiento de la

levadura S. cerevisae.

El uso de un medio de fermentacin con melaza para la

produccin de bioetanol, por su carcter de residuo
agroindustrial es ms econmico que utilizar un medio sinttico.

El uso de melaza como fuente de carbono es un subproducto

con alto potencial para la produccin de bioetanol.

AGRADECIMIENTOS

PROFAPI 2013
Laboratorios del Posgrado en Biotecnologa:

Patologa, Biologa Celular y Molecular.

Laboratorio de Nutracuticos

AGRADECIMIENTOS
DIRECTORES DE TESIS:
Dra. Erika Yudit Ros Iribe
Dr. Oscar M. Hernndez Caldern

COMIT DE EVALUACIN:
Dra. Edith Oliva Cuevas Rodrguez
Dra. Maritza Elizabeth Cervantes Gaxiola

AGRADECIMIENTOS

FAM. VARGAS LUNA

AGRADECIMIENTOS

FAM. RUELAS CANIZALES

AGRADECIMIENTOS

MI GRAN AMOR

AGRADECIMIENTOS

UN BUEN EQUIPO!!!

AGRADECIMIENTOS

MIS AMIGOS Y MIS COMPAEROS

 Gra
cias
por su
atenci
n !!!