Extrao Lquido-Lquido

Operao Unitria de transferncia de massa

utilizada para separar componentes presentes em
uma soluo e/ou suspenso, distribuindo-os
entre fases lquidas parcialmente solveis ou
insolveis.

PURIFICAO DE PRODUTOS BIOTECNOLGICOS

ELLBio

Bioprodutos
Intracelulares

Rompimento
Celular
Separao
de Clulas

Purificao

Clarificao
Acabamento

Bioprodutos
Extracelulares

BIOPRODUTO

EXTRAO LQUIDO-LQUIDO DE BIOMOLCULAS

ELLBio

Sistemas
Polimricos (PEG)
de Duas Fases
Aquosas
(SPDFA)

Sistemas Micelares
Reversos
Sistemas Micelares de
Duas Fases Aquosas
(SMDFA)

Vantagens comuns
aos 3 mtodos

Rpidos
Baixo custo
Biocompatveis

(SMR)

Processo de separao de fases

Sistema de duas
fases

Meio inicial: soluo

e/ou suspenso
Fase Lquida Inicial

-massa

K=

A FI
AFII

transferncia de massa

FP =

R(%) =

Ae(fase ext)
Ae(inicial)
AFI
Ainicial

. 100

Fase Lquida I
(superior)

Fase Lquida II
(inferior)

separao em funo da diferena de solubilidade da

biomolcula nas fases

1) Dois polmeros no-inicos:

PEG x Dextrana
PEG x Polivinil lcool
PPG x Dextrana
Metil Celulose x Hidroxipropil dextrana
2) Polieletrlito x Polmero no-inico
Sulfato dextrana de sdio x polipropileno-glicol
Carboximetilcelulose de sdio x metil celulose

3) Dois polieletrlitos
Sulfato dextrana de sdio x carboximetildextrana de sdio
Carboximetildextrana de sdio x carboximetilcelulose de sdio
4) Polmero no-inico x Composto de baixa massa molar
PPG x fosfato de potssio
PEG x fosfato de potssio
metoxipolietileno glicol x fosfato de potssio
PPG x glicose
PEG x glicose
PEG x sulfato de magnsio
PEG x citrato de sdio

Fase de fundo
PEG x Dextrana
PPG x Dextrana
PEG x fosfato de potssio
PEG x sulfato de magnsio
PEG x citrato de sdio

Rpida separao de fases

Baixo custo
Elevada seletividade na separao baseada na solubilidade

Diagrama de fases:
ordenada: composio da molcula de maior concentrao na fase de
TOPO (PEG, por exemplo)
abscissa: composio da molcula de maior concentrao na fase de
FUNDO (Fosfato, por exemplo)
ambos os componentes do sistema esto presentes nas duas fases
o diagrama pode ser construdo, determinando-se a composio das fases
em equilbrio de uma srie de sistemas
pontos acima da curva binodal: formao de duas fases
pontos abaixo da curva binodal: nica fase
Formao do SPDFA depende da concentrao
dos componentes do sistema

Composio da fase Topo

PEG
(%massa)

T
Composio
inicial

Linha de
amarrao ou
tie line

Curva binodal

B
Ponto crtico

Fosfato (%massa)

Curva de equilbrio de um sistema PEG/fosfato

Composio da
fase de Fundo

Linha de amarrao
sistemas cuja composio inicial encontra-se sobre uma mesma linha de
amarrao possuem a mesma composio final
As relao de volumes entre as fases varia com a composio de acordo com a razo entre os segmentos TM e BM
Segmento TM proporcional ao volume da fase de FUNDO
Segmento BM proporcional ao volume da fase de TOPO
C - Ponto crtico composies e volumes da fase TOPO e FUNDO so
iguais. Sistema instvel.

VOLUMES DAS FASES EM

FUNO DAS
CONCENTRAES DOS
COMPONENTES DO
SISTEMA DE EXTRAO
POR SPDFA

P E G 6 0 0 (% p /p )

50
pH
pH
pH
pH

40

6,5
7,0
8,0
9,0

30

Curvas binodiais de sistemas com

PEG 600 em diversos valores de
pH

20

10

0
0

10

15

20

25

Fosfato de Potssio (% p/p)

A variao do pH altera a razo H2PO4-/HPO4-2

varia a composio o equilbrio entre as fases

Curvas binodiais de sistemas

com PEG 6000 em diversos
valores de pH

P E G 6 0 0 0 (% p / p )

50

pH
pH
pH
pH
pH

40

30

20

10

0
0

10

Fosfato de Potssio (% p/p)

15

5,0
6,5
7,0
8,0
9,0

50
PEG
PEG
PEG
PEG

P E G ( % p /p )

40

600
1500
4000
6000

30

20

10

0
0

10

15

20

25

Fosfato de Potssio (% p/p) pH 8,0

Curvas binodiais de sistemas com massas

molares 600, 1500, 4000 e 6000 em pH 8,0

frmula geral: HO-(CH2CH2)n-CH2CH2OH.

Massas molares:

Prtica:

Abaixo de 1000 Daltons: lquido

Solues-Estoque
50% m/m

Acima de 1000 Daltons: slido (p, flocos)

No se
trabalha com
volume
devido alta
viscosidade

FATORES QUE INFLUENCIAM NO

COEFICIENTE DE PARTIO (K)
DE BIOMOLCULAS
Interaes Hidrofbicas
Cargas superficiais / pH
Diferena de Potencial Eltrico entre as Fases
Efeito de Salting-Out da fase salina
Diferenas de Viscosidade
Diferenas de Densidade
Interaes Bioespecficas
Diagramas de Fases (conc. PEG e sal, p. ex.)
Massa molar da biomolcula

Fatores Ambientais
1 Concentrao de Polmeros
2 Tipo e Concentrao de Sal
3 Ligantes
4 Massa Molar do PEG
5 pH
6 Temperatura
7 Tempo de Mistura e Separao

Fatores Estruturais
1 Resduos hidrofbicos
2 Massa molar da Biomolcula
3 Formato da biomolcula

Principais parmetros para

avaliao do processo

R topo (%)

C topo Vtopo
Cinicial Vinicial

100

Rtopo = rendimento na fase de topo (%)

Ctopo = concentrao ou atividade da biomolcula na fase de topo (g/L ou U/mL)
Cinicial = concentrao ou atividade da biomolcula na amostra antes da extrao
(g/L ou U/mL)

K biomolcula alvo
S
K protenas totais

BM (

C topo Vtopo C fundo Vfundo

Cinicial Vinicial

).100

PEG/Sodium Citrate

clulas na interface

PEG/Potassium Phosphate

clulas no fundo

Clarificao simultnea purificao

Extrao de retamicina (fase de topo) de meio contendo clulas de

Streptomyces olindensis (fase de fundo) em SPDFA formados por
PEG/citrato e PEG/fosfato: (1) PEG 400, (2) PEG 1500 e (3) PEG 6000).

Tm como base a capacidade que as biomolculas tm de reconhecer e se

ligar a outras molculas, especificamente

Interaes por afinidade: aumentam a partio - K Kaf

O ligante ligado covalentemente ao polmero em geral PEG

formao do complexo polmero-ligante-biomolcula

O PEG reage facilmente com ligantes, pois contm hidroxilas substituveis

O ligante pode ser natural ou sinttico

 custo x benefcio deve ser favorvel

o ligante deve ser bifuncional um stio de ligao para afinidade com a
biomolcula e outro stio para imobilizao no polmero
deve ser estvel durante a imobilizao
deve ser estvel durante o processo de extrao
no deve conter outros grupos que tenham afinidade por outras partes da
biomolcula
no deve ser txico
disponvel
fcil rompimento da interao polmero/biomolcula.

Exemplos de material purificado por partio de afinidade

Sistema

Material purificado

Ligante

PEG/Dextrana

-galactosidase

APGP

PEG/palmitato

BSA e -lactalbumina

cidos graxos

PEG/fosfato

Protena A

IgG humana

PEG/fosfato

Penicilina acilase

Trimetilamina

PEG/Dextrana

Tripsina

Inibidor de tripsina

PEG/Dextrana

Lipossomos

Avidina

Dext./Hidropr
opildextrana.

Quimosina

pepstatina

PEG/Dextrana

Mdulos de carbohidrolases

Domnios de ligao da
celulose

PEG/Dextrana

Membranas da glndula lacrimal

Aglutinina de trigo

PEG/fosfato

Amido

Glicoamilase

PEG/Dextrana

Aglutinina de germe de trigo

Membrana plasmtica de
fgado de rato

PEG/Dextrana

cidos graxos de cadeia entre C2 C18

Albumina do soro humano, lactoglobulina, hemoglobulina,

mioglobina

PEG/Dextrana

cidos graxos saturados de cadeia entre

C2 C18 e insaturados de 18:1, 18:2 e
18:3, grupos acila e Benzoatos

Albumina, lizozima, ribonuclease,

2- macroglobulina

PEG/Dextrana

IgG com fludo de ferro magnetizado

Protena A

Sistema de afinidade: fase superior rica em PEG-ligante e a

molcula alvo a ser purificada e fase inferior rica em sal
(sulfato de sdio) e contaminantes.

Exemplo de reciclagem do polmero

Protenas purificadas por partio de metal-afinidade em SDFA

Protena

Metal

Citocromo c de Candida krusei

Cobre

Hemoglobina bovina

Cobre, Ferro

Eritrcitos

Cobre, Zinco

2macroglobulina

Cobre, Zinco

Hemoglobina humana

Cobre

Fosvitina

Ferro

Oxinitrilase

Cobre

Desidrogenases alcolicas, lactato e malato

desidrogenase

Cobre, Nquel, Zinco e

Cdmio

Linfcitos

Cobre, Nquel, Zinco

Lactato desidrogenase

Cobre

Clulas de mamferos

Cobre

Peroxidase de nabo

Cobre

Peroxidase de soja

Cobre

Proteina de membrana: citocromo bo(3) ubiquino

l oxidase c

Cobre

Lactato desidrogenase acoplada a resduo

de polihistidina

Cobre

Biomolculas nucleotdeo-dependentes purificadas em SDFA

com afinidade a corantes.
Biomolcula
Sistema

Ligante acoplado
ao PEG

PEG/
Dextrana

Lactato desidrogenase

Corante triazina
Cibacron Blue F3G-A

PEG/
fosfato

Lactato desidrogenase

Eudragit-Cibacron Blue

PEG/
Dextrana

Fosfofrutoquinase de
levedura

Cibacron Blue
F3G-A-PEG

PEG/
Dextrana

Isoenzimas de fosfatase
alcalina

Procion Yellow
H-E3G-PEG

PEG/
Dextrana

Fosfoglicerato quinase

Cibacron Blue-PEG

PEG/
Dextrana

Formato desidrogenase

Cibacron Blue-PEG

PEG/
fosfato

Xilose redutase

Drimaren

K af

K ( PEG ligante )
K ( PEG sem ligante )

Equipamentos para extrao com sistemas

de duas fases aquosas
Extratores e colunas de extrao lquido-lquido tm
basicamente duas funes:
1. Estabelecer o contato entre as duas fases lquidas do
sistema para possibilitar a transferncia de massa
2. Separar os dois lquidos aps a extrao

Equipamento por estgios

Misturador decantador*
Misturador decantador em cascata vertical

Equipamentos de contato diferencial

Coluna de extrao por estgios
Coluna de extrao spray*
Coluna de extrao com recheio
Extrator de discos rotativos perfurados
Extrator Graesser

Esquema de um misturador-decantador.

Equipamentos centrfugos
Mais importante: extrator Podbielniak
Tambor cilndrico com placas concntricas
Fase pesada alimentada no centro do tambor enquanto
a fase leve alimentada na periferia do extrator

Escoamento contra-corrente

Desenho esquemtico de um extrator Podbielniak.

https://www.youtube.com/watch?v=Si0QYeF5ZHc
http://www.powershow.com/view/175b82MjdhO/LIQUIDLIQUID_EXTRACTION_powerpoint_ppt_presentation