Endonucleasas de Restriccin

Enzimas que tienen la capacidad de cortar DNA doble cadena en una

secuencia especfica o restringida
Extradas y clonadas de bacterias:
Nombre de ER: segn la bacteria a partir de la cual fue aislada
Ejemplo: EcoRI
Eco: Gnero y especie: Escherichia coli
R: Cepa RY12
I: primer ER aislada de este organismo

Forman parte de un sistema de Restriccin-Modificacin, actuando

como un sistema de defensa contra patgeno, protegindolas del
ataque de DNA forneo (ej.: bacterifago).
R: endonucleasa (corta DNA doble cadena rompiendo uniones
fosfodister)
M: modifica al DNA por metilacin (metilasa)
Es decir, cada enzima de restriccin tiene una metilasa asociada.
Ambas enzimas reconocen la misma secuencia de bases. La metilasa
metila una base determinada siempre dentro de la secuencia de
reconocimiento, mientras que la endonucleasa puede cortar dentro
de la secuencia de reconocimiento o fuera de ella, dependiendo del
tipo de enzima.
La metilacin en las dos hebras del DNA evita que la Enzima de
Restriccin pueda cortar la molcula de DNA. Este mecanismo es
empleado por las bacterias para proteger a su propio DNA genmico
y plasmdico del ataque de sus propias Enzimas.
1

Ejemplo: (especfico para las de Tipo II)

1) Ambas cadenas metiladas
CH3
5---- GAATTC ---- 3
3---- CTTAAG ---- 5
CH3
2) Slo una cadena metilada

5---- GAATTC ---- 3

3---- CTTAAG ---- 5
CH3

3) Ninguna cadena metilada

5---- GAATTC ---- 3

3---- CTTAAG ---- 5

no hay ni metilacin ni restriccin

M.EcoRI
R.EcoRI

CH3
5---- GAATTC ---- 3
3---- CTTAAG ---- 5
CH3

hay metilacin y no restriccin

M.EcoRI
R.EcoRI

CH3
5---- GAATTC ---- 3
3---- CTTAAG ---- 5
CH3

no hay metilacin, s restriccin

M.EcoRI
R.EcoRI

5---- G
AATTC ---- 3
3---- CTTAA
G ---- 5

El sistema R-M funciona como un sistema inmune

Mecanismo para resistir el ataque viral
Permite a la bacteria distinguir entre DNA propio y DNA forneo:
las ER digieren al DNA forneo no metilado
y protegen DNA propio por metilacin

Por qu el sistema R-M funciona como un sistema inmune?

CH3

Caso 1

5---- GAATTC --------------- AAGCTT---- 3

3---- CTTAAG ----------------TTCGAA---- 5
CH3

EcoRI

HindIII

DNA del fago con las

secuencias de
reconocimiento de
ambas ER

Lisis
Bacteria EcoRI+ HindIII-

Caso 2

No hay lisis
Bacteria EcoRI- HindIII+
CH3

Caso 3

5---- GAATTC --------------- AAGCTT---- 3

3---- CTTAAG ----------------TTCGAA---- 5
CH3

EcoRI

HindIII

DNA del fago con las

secuencias de
reconocimiento de
ambas ER

No hay lisis
3
Bacteria EcoRI+ HindIII-

DNA metilasas o metiltransferasas:

Transferencia de un grupo metilo desde una molcula donante
(SAM) a una A y C:

No requieren Mg2+ como cofactor

Eucariotas: asociadas a la inactivacin gnica: metilaciones en la
posicin C5 de las C en islas CpG
Procariotas: participan principalmente del sistema R-M
En las cepas de E.coli de laboratorio existen 3 DNA-MT:
Sistema hsd: AAC(N6)GTGC and GCAC(N6)GTT
Dam metilasa: GATC
Dcm metilasa: CCAGG y CCTGG

DNA plasmdico aislado de cepas E.coli Dam+ son resistentes al

corte por MboI (GATC)
Si se quiere clivar una molcula recombinanate con ER sensibles a la
metilacin por estas MT, la misma debe ser amplificada y aislada a
partir de cepas Dam- y Dcm-

Sistema de Restriccin metilasa dependiente

Endonucleasas que clivan DNA doble cadena cuando est doblemente
metilado o hemimetilado
En E.coli existen tres sistemas:
MrcA:

m5

MrcBC:

Pum5CG

Mrr:

CG

m6

Clasificacin de ER
Composicin de las subunidades
Especificidad de la secuencia de reconocimiento
Sitio de clivaje
Requerimiento de cofactores

Clasificacin de ER
ER

Tipo I

Tipo II

Tipo IIs

Tipo III

Estructura
proteica

Bifuncional, 3
subunidades

Unifuncional,
endonucleasa y
metilasa en
enzimas
separadas

Unifuncional,
endonucleasa y
metilasa en
enzimas
separadas

Bifuncional, 2
subunidades
distintas

Sitio de
reconocimiento

Asimtrico y
bipartito

Secuencia
palindrmica
(simtrica),

Asimtrico y
continuo

Asimtrico,

4-6 pb (tb de
8pb)
Sitio de clivaje

No especfico
1000pb del
sitio de
reconocimiento

Requerimientos

Ejemplo

Uso en biologa
molecular

ATP para
moverse del
sitio de
reconocimiento
al de clivaje,
Mg2+, SAM
EcoKI

En el mismo sitio
de
reconocimiento
o adyacente a
este
No ATP
Mg2+, (la M
requiere SAM)

EcoRI

A distancias
fijas del sitio
de
reconocimiento
(fuera del
mismo)
Mg2+, (la M
requiere SAM)
No ATP

AwlI

5-7 pb.
R: secuencia
duplicada en
direcciones
opuestos
24-26 pb ro
abajo del sitio
de
reconocimiento
ATP para
moverse del
sitio de
reconocimiento
al de clivaje,
Mg2+, SAM
EcoP15

AACN6GTGC

CAGCAG(N)CTGCTG

TTGN6CACG

GTCGTC(N)GACGAC

No generan
fragmentos de
tamao
definido

Generan
fragmentos de
tamao definido,
se usan en el
laboratorio!!!

Generan
fragmentos de
tamao definido

No generan
fragmentos de
tamao definido

Tipo II (las que se emplean en el laboratorio)

Las secuencias de reconocimiento pueden ser:
sec palindrmicas y continuas (reconocidas por homodmeros)
Ejemplo: EcoRI

Secuencias simtricas y discontinuas (reconocidas por homodmeros)

Ejemplo: BglI

sec asimtricas y continuas (reconocidas por heterodmeros)

Ejemplo: BbvCI

Cdigo de una letra

N = A or C or G or T

Extremos:
Romos:
5----CCCGGG ---- 3
3----GGGCCC ---- 5

SmaI

5----CCC
3----GGG

GGG ---- 3
CCC ---- 5

Cohesivos:
5 protruyente
5---- GAATTC ---- 3
3---- CTTAAG ---- 5

EcoRI

5---- G
AATTC ---- 3
3---- CTTAA
G ---- 5

3 protruyente
5---- CTGCAG ---- 3
3---- GACGTC ---- 5

PstI

5----CTGCA
3----G

G ---- 3
ACGTC ---- 5

La ligacin de extremos cohesivos requiere complementariedad de

secuencia
La ligacin de extremos romos no requiere de secuencias
complementarias: dos extremos romos cualquiera pueden ser unidos por
la DNA ligasa.
La eficiencia de ligacin de extremos cohesivos es mayor que la de
extremos romos.

Isoesquizmeros:
Son distintas ER que reconocen la misma secuencia, generalmente con
distintas especificidades. Pueden generar:
los mismos extremos: Acc65I y KpnI
5----G
GTACC ---- 3
3----CCATG
G ---- 5

5----GGTACC ---- 3
3----CCATGG ---- 5

distintos extremos:

5----CCCGGG ---- 3
3----GGGCCC ---- 5

5----CCCGGG ---- 3
3----GGGCCC ---- 5

SmaI

XmaI

5----CCC
3----GGG

GGG ---- 3
CCC ---- 5

5----C
CCGGG ---- 3
3----GGGCC
C ---- 5

ER que reconocen distintas secuencias, pero dejan los mismos

extremos:
5----GGATCC ---- 3
3----CCTAGG ---- 5

5----AGATCT ---- 3
3----TCTAGA ---- 5

BamHI

BglII

5----G
GATCC ---- 3
3----CCTAG
G ---- 5

5----A
GATCT ---- 3
3----TCTAG
A ---- 5

Cmo generar nuevas secuencias de corte

1- Corte, filling in/trimming back, religacin:
Filling in (5 protruyente)
5---- GAATTC ---- 3
3---- CTTAAG ---- 5

EcoRI

5---- G
AATTC ---- 3
3---- CTTAA
G ---- 5

fill in (con DNApol +

dNTPs)

ligasa
5---- GAATTAATTC ---- 3
3---- CTTAATTAAG ---- 5

5---- GAATT
3---- CTTAA

AATTC ---- 3
TTAAG ---- 5

XmnI (GAANN/NNTTC)

Trimming back (3protruyente)

5---- CTGCAG ---- 3
3---- GACGTC ---- 5

PstI

5----CTGCA
3----G

G ---- 3
ACGTC ---- 5

3-5exonucleasa
5----C
3----G

G ---- 3
C ---- 5

Ligados entre s o a otros

fragmentos con extremos romos10

2- Ligacin de extremos complementarios:

BamHI

5----GGATCT---- 3
3----CCTAGA ---- 5

5----G
GATCC ---- 3
3----CCTAG
G ---- 5

Ligasa
BglII

5----A
GATCT ---- 3
3----TCTAG
A ---- 5

5----AGATCC ---- 3
3----TCTAGG ---- 5

MboI (/GATC)
3- Ligacin de extremos romos:
AluI

5----AG
3----TC

EcoRV 5----GAT
3----CTA

CT---- 3
GA---- 5
ATC---- 3
TAG---- 5

5----AGATC---- 3
3----TCTAG---- 5

Ligasa

MboI (/GATC)

5----GATCT---- 3
3----CTAGA---- 5

11

Usos en el laboratorio
Generar fragmentos de DNA de tamao definido para:
generar molculas recombinantes: clonado
NcoI

NcoI

HindIII

HindIII

Digestin con
ER
Fragmento
amplificado
p

Yep51

Ligacin

Screening de transformantes por ER

Digestin
con
HindIII

Calle1: markers (23.13, 9.42, 6.55,

4.36, 2.32, 2.07 y 0.56 kpb)
Calle2: vector digerido sin inserto
Calle3: vector con inserto digerido
(digestin completa)

12

En el laboratorio: reaccin de digestin con ER

1) Eleccin de la ER
Extremos, secuencia y frecuencia de corte, y la cepa

2) Reaccin de digestin
DNA (1 g) libre de contaminantes
Buffer de reaccin (1X)
(viene 10X)

ER (1 l= 10U)

H2O csp 50L

pH (Tris-Cl)
sales (NaCl o KCl) =Fi
cofactores (Mg2+)
BSA

mantener en fro
ltima en ser agregada
glicerol < 5% v/v
1UE: cantidad de enzima que corta
completamente 1 g de DNA del fago
lambda en un volumen de 50 l en 1 hs
usando el buffer correspondiente

3) Mezcla: pipetear + spin-down

4) T 37C ( 50-65C)
5) tiempo: 1 hs
(compromiso entre tiempo y cantidad de enzima)

Tiempos muy prolongados: cortes inespecficos: Actividad STAR

6) Frenar de la reaccin:
calor o shock trmico (65-80C por 20)
fenol/cloroformo y posterior precipitacin del DNA

13

Actividad STAR:
Algunas enzimas (en condiciones de reaccin que no son las ptimas) pueden
producir cortes en secuencias que son similares a sus secuencias de corte.
Ejemplo:
EcoRI en condiciones ptimas cliva:
5 G/AATTC 3
en condiciones no ptimas puede clivar:
5 N/AATTN 3
Condiciones que contribuyen a la actividad STAR
1- glicerol [>5% v/v]
2- alta UE/ g of DNA (>100 UE/g)
3- baja Fi [<25 mM]
4- alto pH [>pH 8.0]
5- sv orgnicos (DMSO, etanol)
6- sustitucin de Mg++ por otros cationes divalentes (Mn++, Cu++, Co++, Zn++)
7- tiempo de incubacin mayor al ptimo
8- fragmento de DNA amplificado por PCR, sin previa purificacin del mismo
Cmo inhibir la actividad STAR
1- mn UE (digestin completa)
2- DNA libre de contaminantes
3- aumentar Fi 100-150 mM
4- pH 7.0.
5- Mg++

14

En los catlogos se describen las distintas caractersticas de cada

enzima, como las siguientes:

15

Secuencia a digerir:
Existen programas en internet en los cuales uno puede introducir la
secuencia de bases completa simple cadena y obtener el MAPA DE
RESTRICCIN. Ejemplo: Neb cutter V2.0
Secuencia del gen BCY1:

No presenta las secuencias de corte para HindIII ni NcoI

16

Digestin doble
Digerir un mismo fragmento de DNA con dos ER distintas. Por ejemplo:
hacer clonado direccional
evitar tener que precipitar al DNA dos veces, lo cual podra resultar
en la prdida de masa de DNA
ahorrar tiempo
A tener en cuenta:
En el vector:
Las secuencias de reconocimiento de las ER a emplear no debern
solaparse, y debern estar a una determinada distancia en pb cuando
se realiza una digestin doble.

Nco
I

En el fragmento: la distancia del sitio de corte al extremo del

fragmento NcoI
Primers:
Forward: 5' GACCATGGTATCTTCTTTGCCCAAGG 3'
Reverse: 5' GGAAGCTTTTAATGTCTTGTAGGAT 3'
HindIII

17

Digestin doble

Buffer de reaccin compatible

Incompatibilidad

digestin secuencial :

a) correccin del buffer o T

b) precipitacin del DNA
Tabla de doble entrada:

18