PCR en Tiempo Real

Mg.Sc. Blgo. LUIS GUZMN MASIAS

INSTITUO PERUANO DE BIOLOGA MOLECULAR
luis_guzman@ipbiomol.com

Uso de PCR en tiempo real en

publicaciones indexadas (Medline)

PCR
1983 1985 : Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR)
Kary Mullis
Ventajas:
Alta sensibilidad
Alta especificidad
Rapidez
Otras ventajas:
Deteccin a partir de cualquier muestra biolgica (sangre,
piel, cabellos, saliva, lquido cefaloraqudeo, etc)
No es necesario que la muestra sea estril
Deteccin de un patgeno en particular an en presencia
de otros patgenos.

VARIANTES DE PCR
RT-PCR

: deteccin de mRNA

PCR-RFLP : polimorfismo gentico

RAPDs

: amplificacin con random primers - polimorfismo

PCR Nested : amplificacin de una secuencia dentro de otra

previamente amplificada
PCR Multiplex: varios targets diferentes en forma simultnea
Inverted PCR: para conocer secuencias flanqueadoras
Long PCR

: amplificacin de fragmentos grandes 10 -20 kb.

APLICACIONES DE PCR
Diagnstico clnico
Monitoreo y Evaluacin de terapia
Deteccin de cepas resistentes a antibiticos
Deteccin de mutaciones puntuales
Polimorfismo gentico
Filiacin humana
Medicina Forense
Pedigr animal
Control de calidad

POR QU PCR EN TIEMPO REAL EST

DESPLAZANDO AL PCR ESTANDAR?
QUE VENTAJAS PRESENTA EL
PCR EN TIEMPO REAL?

PCR Standard
Real
Anlisis de punto final
Deteccin del producto por
Electroforesis en gel

vs.

PCR Tiempo

Anlisis de la cintica de
la reaccin
Deteccin del producto en
cada ciclo de la reaccin

DETECCION DEL PRODUCTO EN

CADA CICLO DE REACCION
1. Compuestos fluorescentes:
- compuestos que emiten fluorescencia cuando se
unen a dsDNA
- interaccin inespecfica
- Sybr green, EtBr,YOYO-1, entre otros
- Puede unirse a dimeros
2. Reporteros fluorescentes :
- Sondas Taqman
- Beacons moleculares
- FRET

SYBR Green
Absorbe a 480 nm, y

emite a 520 nm.

Desventaja: se une a

cualquier DNA de
doble cadena de
forma inespecfica
(dmeros
de primers y/o
productos
inespecficos).

Beacons moleculares

El Fluorforo emite seal

cuando
el
agente
bloqueador (Quencher) se
encuentra alejado por
efecto de la hibridacin a
la secuencia target

TaqMan PCR : generacin de seal por hidrlisis

de sonda.

FAM : maxima
emisin a 535 nm
TAMRA : mxima
absorcin a 560nm

FRET :

Fluorescence Resonance Energy Transfer

HARDWARE & SOFTWARE

SOFTWARE

Ventajas del PCR en tiempo real

Simple y rpida (semi-automatizada).
No hay manipulacin post-PCR: disminuye el riesgo de

contaminacin por amplicones.

Cuantificacin precisa del DNA o RNA inicial.
Alta sensibilidad y especificidad
Discriminacin de productos inespecficos con la opcin
curva de desnaturalizacin (Melt-Curve).
Deteccin de ms de un producto especfico en una misma
reaccin.
DETECCION DEL PRODUCTO EN CADA CICLO DE REACCION
LO CUAL PERMITE UN ANALISIS DE LA CINETICA DE REACCION

 En teora el Producto (P) se incrementa exponencialmente

con el # ciclos (n).
Depende del numero de copias templado iniciales (T)

P (2) T
n

Sin embargo, reacciones con diferentes numero de

copias iniciales llegan al mismo nivel de plateau

FASE PLATEAU

PCR no es 100% eficiente

El producto de PCR no siempre se duplica con cada
ciclo.

P T(1 E)

E = eficiencia del PCR

Generalmente la eficiencia es de 80-90%
Los productos pequeos se amplifican con mayor
eficiencia que los productos largos

EFECTO DE LA EFICIENCIA EN LA CANTIDAD DE PRODUCTO OBTENIDO

 Factores limitantes en la eficiencia del PCR:

- cantidad de cebadores disponibles
- actividad de la Taq DNA Polimerasa
Plateau : no hay mayor incremento del producto
PCR Standard: Anlisis de punto final (End point detection)
Deteccin al final del total de ciclos por electroforesis en gel
(en fase plateau)

CANTIDAD DE DNA (escala aritmtica) vs. NUMERO DE CICLOS

Los productos de amplificacin no se detectan en los primeros ciclos
porque estn por debajo de la escala utilizada.
Recin se observa la curva en los ltimos ciclos hasta llegar a la fase de
plateau.

CANTIDAD DE DNA (escala logaritmica) vs NUMERO DE

CICLOS
Se observa diferencias ya desde los ciclos iniciales. Relacin como
lnea recta al utilizar logaritmos, porque la amplificacin por PCR
es una reaccin logartmica.

Escala aritmtica

La misma reaccin de PCR en escala logaritmica - se aproxima a

la grfica terica.

Segn las curvas tericas, se debe obtener una lnea recta en la parte
lineal de la reaccin de PCR. En este caso entre ~20 a ~1500
unidades de fluorescencia arbitraria.

Analizando la misma regin en una escala regular (aritmtica),

veremos que la parte lineal es la primera parte de la curva.
IMPORTANTE: se debe examinar la reaccin de PCR mientras se
encuentra en la fase lineal.

Valores de Threshold & CT

Para cada muestra, el software determina en qu ciclo, el valor de la

fluorescencia emitida cruza la linea arbitraria (Threshold).

(Ciclo crtico / Threshold cycle). Este

valor es inversamente proporcional a la cantidad inicial de
molculas especficas en la muestra original.
Este punto se denomina CT

CONTROLES DE REACCION : ELIMINACION DE RUIDO

NTC:
tubo control
sin DNA
templado

RUIDO

Grafica semilogaritmica

Grafica regular

Es importante que el threshold este en la parte lineal de la reaccin.

Esto se ve mas facilmente en la grafica logaritmica.
An cuando el threshold estar cerca al fondo de la curva regular, deber
ser lo suficientemente alto para que los valores de fluorescencia sean
debido a la amplificacin y no al ruido.

Cuantificacin de DNA o cDNA

(colocando diluciones de la misma muestra)

A menor concentracin de la secuencia target en la muestra inicial, se

necesitar mas ciclos para ser detectada, por lo tanto se obtienen valores de
CT

mayores para muestras mas diluidas

El Plot de valores Ct de las diluciones vs. concentracin resulta en una

grfica lineal, y debe presentar un alto coeficiente de correlacin (>0.990).

PROBLEMAS
PRODUCTOS NO ESPECIFICOS (artefactos) : que
pueden incrementar el valor de fluorescencia obtenida
durante la reaccin. Esto es mas frecuente cuando se utiliza
SYBR-green.
Unin inespecfica de primers (mispriming): por unin de los
primers a secuencias parcialmente complementarias presentes
en el DNA o cDNAs de la muestra

Dmeros : los primers pueden hibridarse entre ellos creando

productos pequeos

CURVA DE DENATURACION
Muesta el perfil de denaturacin de los productos amplificados.

(no se observan productos inespecficos)

Una temperatura de denaturacin diferente significa un

producto diferente. Dmeros: menor temperatura de fusin.

dmeros

PCR en tiempo real

Deteccin y cuantificacin utilizando reporteros

fluorescentes.

Fluorescencia emitida es proporcional a la

cantidad de producto del PCR.

Se puede realizar el anlisis de varios targets a la

vez (Multiplex) utilizando sondas marcadas con

diferentes fluorforos

Otras consideraciones
Controles
Problemas de Inhibicin - falsos negativos
Estndares internos (genes de referencia,
control interno, control de carga, triplicados)
Optimizacin
Reproducibilidad
Validacin
Personal
Costos

APLICACIONES EN
INVESTIGACION
DNA : - Identificacin de genes de virulencia o de
resistencia a drogas
- Genotipificacin de cepas o subespecies
- Deteccin de mutaciones puntuales
- Estudio de de polimorfismos de un solo
nucletido (SNPs)
- Cuantificacin del nmero de copias por
clula, o determinacin de clulas iniciales en
una muestra.
RNA : - Deteccin de la expresin de genes
- Efecto de mutaciones sobre la expresin
- Anlisis de mRNAs variantes producidos por
procesamiento diferencial
- Cuantificacin de la expresin

Deteccin de la expresin de genes (deteccin de mRNA)

Perfl de expresin gnica en diferentes tipos celulares en

adultos o durante el desarrollo /diferenciacin

Cambios en la expresin gnica en condiciones

patolgicas

Expresin gnica en respuesta a estmulos: hormonas,

citoquinas, etc

Expresin gnica en respuesta a la presencia de antgenos

de patgenos

Efecto de drogas sobre el perfl de expresin

APLICACIONES AL
DIAGNOSTICO CLINICO
Deteccin /Cuantificacin / Genotipificacin de patgenos:

Virales (carga viral, carga pro-viral)

Bacterianos
Protozoarios
Hongos
Diagnstico temprano (pacientes asintomticos)
Deteccin de genes de resistencia mejor eleccin de terapia
Monitoreo de terapia (enfermedad residual - recada)
Deteccin de marcadores tumorales
Estado del desarrollo / progresin de la enfermedad

DETECCION DE SNPs o
DE MUTACIONES PUNTUALES

Clulas Madre y su
diferenciacin a Linaje
Neuronal:
Ejemplo de Cuantificacin Relativa

La herencia epigentica es regula procesos como proliferacin

y diferenciacin celular manteniendo estados transcripcionales

ATP

ADP

NUCLEOSOMA

(Modificada de Mohrmann y Verrijzer 2005

Modificaciones covalentes
de las histonas nucleosmicas
(Turner 2002)

Modificacin de la cromatina por

complejos multi-ptotecos que
hidrolizan ATP

RNA interferencia

30 min en hielo y
cultivo

Anlisis de Melt

ACTINA
End-Point

OSA1

Colonia
C2
F1g
D3
WT

Ct osa
27,58
28,7
27,1
23,58

Ct Actina
22,99
23,32
22,3
19,82

Ct
4,59
5,38
4,8
3,76

Ct

Fold

0,83 0,5625292
1,62 0,3253354
1,04 0,4863274
1

CUANTIFICACION ABSOLUTA
Translocacin (9,22)
Curva patrn BCR-ABL
Segunda Derivada

Real Time PCR

ejemplo de deteccin en embarazadas a partir de la sexta
semana