Marcadores Moleculares

IDENTIFICACION Y CARACTERIZACION MOLECULAR
IDENTIFICACION Y
CARACTERIZACION
MOLECULAR
AISLAMIENTO DE ADN
http://www.dakotacom.net/~clamunyon/F01MolGen/F01MolGenSyl.html
ELECTROFORESIS DE ADN
http://www.mun.ca/biology/scarr/2250_Genetic_Engineering_2003.htm
ELECTROFORESIS DE
ADN
ELECTROFORESIS DE
ADN
ELECTROFORESIS DE
ADN
http://cwx.prenhall.com/horton/medialib/media_portfolio/22.html
http://www.ornl.gov/sci/techresources/Human_Genome/education/images.shtml
ELECTROFORESIS DE
ADN
SDS-PAGE
SDS-PAGE
SOUTHERN
BLOTT
http://lsvl.la.asu.edu/resources/mamajis/southern/southern.html
ENZIMAS DE
RESTRICCION
TRANSFORMACION
http://wps.prenhall.com/wps/media/objects/376/385232/Media-Portfolio/index.html
TRANSFORMACION
HIBRIDACION in situ
http://www.irn.pdx.edu/~newmanl/GraphicsCatalog.html
HIBRIDACION in situ
http://www.irn.pdx.edu/~newmanl/GraphicsCatalog.html
SECUENCIACION
REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA

(PCR)
 Desarrollada por Kary Mullis, 1987.
Premio Nobel, 1993
 Enzima DNA polimerasa.
 Síntesis enzimática "in vitro" de millones de copias

a partir de un segmento de DNA.
 La reacción: apareamiento oligonucleótidos

dependiente y polimerización enzimática
http://www.agen.ufl.edu/~chyn/age4660/lect/lect_07/lect_07.htm
1. Desnaturalización:
Calentar a una alta temperatura
94 –95°C para denaturar DNA
DNA, DNA-primer, y primer
dimer.
2. Alineamiento:
Enfriar a una temperatura que
permita el alineamiento.
3. Extensión:
Calentar a ~72°C para la óptima
incorporación de dNTPs.
http://www.agen.ufl.edu/~chyn/age4660/lect/lect_07/lect_07.htm
 REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA

(PCR) PUEDE SER UTILIZADA PARA
MULTIPLICAR REGIONES ESPECÍFICAS
DEL DNA DE CUALQUIER
MICROORGANISMO QUE VIVA EN O SOBRE
UNA PLANTA, ANIMAL O HUMANO (BUENO
OTRO ANIMAL)
 NO ES NECESARIO PURIFICAR EL
ORGANISMO Y ASÍ SE PUEDE EVITAR EL
CULTIVO EN LABORATORIO.
LYON, B., BECERRA-LOPEZLAVALLE, A. Molecular Diagnosis of Fungal Pathogens in Cotton.
2003.
SE ESCOGE UNA SECUENCIA COMO UNA

REPRESENTACIÓN DE TODO EL GENOMA
DEL MICROORGANISMO.
Los análisis genotípicos tienen múltiples

ventajas:
 Rapidez
 Sensibilidad
 Especificidad
 Datos estandarizados y fácilmente
cuantificables.
La PCR necesita ser combinada con:
• Métodos de preparación de la muestra.

• Métodos para la detección.
• Métodos análisis.
Electroforesis
Referencia Enferma Enferma Sana Enferma
NYGREN, M. Molecular Diagnostics of Infectious Diseases. Royal Institute of Technology.

Department of Biotechnology. Stockholm. 2000.
p://www.ornl.gov/sci/techresources/Human_Genome/education/images.shtml
TERMOCICLADOR
RT-PCR
REAL TIME PCR

ANÁLISIS PLASMÍDICO
•Consiste en obtener los plásmidos de cada aislado y

separarlos por electroforesis en geles de agarosa
para determinar su número y tamaño, fue una de las
primeras técnicas empleadas en diferentes
microorganismos (Mayer, 1988)
•Una forma sencilla de mejorar esta técnica consiste

en digerir con enzimas de restricción los plásmidos
aislados y así comparar los patrones obtenidos con
diferentes cepas (Maslow y cols., 1993)
•Es una técnica limitada a cepas con presencia de

plásmidos y que dichos plásmidos son por naturaleza
inestables y móviles, por lo que cepas
epidemiológicamente relacionadas pueden presentar
diferentes patrones (Mickelsen y cols., 1985)
REA (Análisis de Restricción Enzimática)
•Consiste en la digestión del DNA cromosómico total

mediante endonucleasas de alta frecuencia de corte y
su posterior electroforesis en geles de agarosa.
•El REA tiene el inconveniente de que produce un

número excesivo de bandas, lo que hace
prácticamente imposible comparar un elevado número
de cepas
•Este problema puede solucionarse transfiriéndo los

fragmentos de DNA separados en el gel a una
membrana de nylon para su posterior hibridación con
una sonda que contenga los genes que codifican para
el rRNA (Grimont y Grimont, 1986; Altwegg y Moyer,
1989)
•Ésta técnica recibe el nombre de ribotipado y reduce

las bandas o marcadores a un número de entre 5 y 20
PFGE (Electroforesis de campo
pulsado)
•Se basa en el empleo de

endonucleasas de baja
frecuencia de corte y posterior
electroforesis en campo pulsado,
permitiendo el análisis de
fragmentos de DNA más grandes
que los obtenidos con el REA (10
- 800 Kb) (Arbeit y cols., 1990;
Maslow y cols., 1993)
•Teóricamente el PFGE se define

cómo una técnica áltamente
reproducible, ya que los
patrones pueden resolverse bien
en un único gel de agarosa y
representan el genoma completo
de la bacteria, y aplicable a
cualquier cepa bacteriana
(Maslow y cols., 1993)
AFLP (Polimorfismos de fragmentos de

amplificación)
•Fragmentos de DNA (80-500

bp) obtenidos a partir de EXTRACCIÓN
DE DNA
endonucleasas de restricción,
seguido de la ligación de DIGESTIÓN DEL DNA CON
adaptadores de LAS ENZIMAS EcoR1 Y Mse1
oligonucleótidos a los
ALINEAMIENTO DE LOS ADAPTADORES EcoR1 Y
fragmentos y la amplificación Mse1 A LOS PRODUCTOS DE RESTRICCIÓN
selectiva por PCR
PRESELECCIÓN DE LOS PRODUCTOS POR PCR
CON LOS PRIMERS "EcoRI + A" Y "MseI +C"
•Marcador altamente AMPLIFICACIÓN SELECTIVA DE LOS PRODUCTOS

informativo, aplicado en PRESELECCIONADOS CON LOS PRIMERS "EcoRI + 3" Y "MseI +3"
estudios que involucran

identidad genética, SEPARACIÓN DE LOS
FRAGMENTOS EN SDS-PAGE
parentesco e identificación de
clones y cultivares.

amplificación)

amplificación)
16S-23S ITS (Espaciador intergénico 16S-23S)
•En bacterias el operón ribosómico contiene los genes

organizados secuencialmente en el siguiente orden:
16S-23S-5S
•Entre éstos genes se encuentran los ITS que contienen

genes que codifican para tRNA y secuencias diana para
la RNasa III
•La secuenciación del 16S-23S ISR en numerosas

especies bacterianas ha demostrado que existen
variaciones importantes en la secuencia y longitud de
ésta región
•La mayoría de bacterias tienen múltiples copias del

operon ribosómico, incrementando la posibilidad de que
existan diferencias en el 16S-23S ISR ente diferentes
cepas, especies y géneros
16S-23S ISR (Espaciador intergénico 16S-23S)
•Además se trata de una región sin actividad

codificante por lo que presenta un ritmo evolutivo
rápido.
•Ello hace posible la utilización de esta región con

fines taxonómicos y epidemiológicos (Gürtler y
Stanisich, 1996).
•De hecho, el análisis completo del 16S-23S ISR o de

sus patrones de RFLP, obtenidos tras digestión
enzimática, ya han permitido tipar con éxito cepas
implicadas en procesos epidemiológicos en distintos
géneros bacterianos (Kostman y cols., 1995; Abed y
cols., 1995; Cartwright y cols., 1995; García-Martínez y
cols., 1996).
16S-23S ITS (Espaciador intergénico 16S-23S)

EXTRACCIÓN
DE DNA
AMPLIFICACIÓN DE
REGIONES ITSs
PURIFICACIÓN DE LOS
FRAGMENTOS AMPLIFICADOS
16S-23S ITS
(Espaciador intergénico 16S-
SECUENCIACIÓN DE LOS 23S)
FRAGMENTOS
ANÁLISIS DE SECUENCIA, SELECCIÓN DE REGIONES ESPECIE

ALINEAMIENTO ESPECÍFICAS
CONSTRUCCIÓN DE DISEÑO Y SÍNTESIS DE INICIADORES

DENDOGRAMA ESPECIE ESPECÍFICAS
ESTANDARIZACIÓN DE CONDICIONES
DE AMPLIFICACIÓN
DETECCIÓN ESPECIE ESPECÍFICA

RANDOM AMPLIFIED POLYMORPHIC DNA (RAPD)
 Fragmentos amplificados por

PCR, utilizando decanucleótidos
sintéticos aleatorios, que sirven EXTRACCIÓN
como primer forward reverse. DE DNA
 Amplifican fragmentos de 0.5-

5kb, que son separados en AMPLIFICACIÓN DE RAPD
electroforesis y el polimorfismo
es detectado como la presencia
o ausencia de bandas de un CONSTRUCCIÓN DE MATRICES
tamaño particular. DE PRESENCIA AUSENCIA
 No se requiere información de
ANÁLISIS DE AGRUPAMIENTO
secuencia para la construcción ANALISIS MULTIVARIADO DE LOS DATOS
de los primers.
 Distribución aleatoria a lo largo CONSTRUCCIÓN DE

del genoma, permite estudios DENDOGRAMA
de mapeo genético.
SEQUENCE CHARACTERIZED AMPLIFIED REGION (SCARs)
 SCARs son fragmentos de DNA amplificados por

PCR, utilizando primers específicos de 15-30 bp.
 Diseñados a partir de secuencias de nucleotidos

establecidas a partir de RAPD.
 Al utilizar iniciadores más largos se evita el

problema de la baja reproducibilidad de los RAPDs.
 Los SCARs han sido aplicados en estudios de mapeo

genético, selección asistida por marcadores.
MICROSATÉLITES
 Marcadores moleculares de loci, unidades repetidas

en tandem de motivos nucleotidicos muy cortos (1-5
pb).
 Cuando se conoce la secuencia de nucleótidos que

delimita la región microsatélite, se diseñan
iniciadores especie específicos, para amplificar esta
región.
 Alto nivel de polimorfismo, marcadores informativos

para estudios de genética de poblaciones, nivel de
Rep-PCR
•Es una técnica alternativa al RAPD dado que se basa en

la PCR de regiones conservadas del genoma
•Al igual que en el caso del RAPD es necesaria una

minuciosa estandarización de la técnica para asegurar
su reproducibilidad (Tyler y cols., 1997)
•Dentro de éste grupo de técnicas se encuentran el REP

y el ERIC. El REP son regiones de entre 33 y 40 pb que se
repiten entre 500 y 1000 veces en el genoma de
Escherichia coli y Salmonella typhimurium, ocupando
aproximadamente el 1% de su genoma (Stern y cols.,
1984)
•El ERIC son regiones de entre 124 y 127 pb que se

repiten entre 30 y 150 veces en el genoma de las
Enterobacterias (Hulton y cols., 1991)
Rep-PCR
PODER DISCRIMINATIVO DE LAS TÉCNICAS DE TIPADO

(Adaptado deSavelkoul y cols., 1999).
MICROARREGLOS
 Mezcla de
biomoléculas y
microchips, para
detección e
identificación de
secuencias de ácidos
nucleicos.

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IDENTIFICACION Y CARACTERIZACION MOLECULAR

REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA

 Enzima DNA polimerasa.

 Síntesis enzimática "in vitro" de millones de copias

 La reacción: apareamiento oligonucleótidos

 REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA

SE ESCOGE UNA SECUENCIA COMO UNA

Los análisis genotípicos tienen múltiples

La PCR necesita ser combinada con:

• Métodos de preparación de la muestra.

Referencia Enferma Enferma Sana Enferma

NYGREN, M. Molecular Diagnostics of Infectious Diseases. Royal Institute of Technology.

REAL TIME PCR

•Consiste en obtener los plásmidos de cada aislado y

•Una forma sencilla de mejorar esta técnica consiste

•Es una técnica limitada a cepas con presencia de

REA (Análisis de Restricción Enzimática)

•Consiste en la digestión del DNA cromosómico total

•El REA tiene el inconveniente de que produce un

•Este problema puede solucionarse transfiriéndo los

•Ésta técnica recibe el nombre de ribotipado y reduce

•Se basa en el empleo de

•Teóricamente el PFGE se define

AFLP (Polimorfismos de fragmentos de

•Fragmentos de DNA (80-500

•Marcador altamente AMPLIFICACIÓN SELECTIVA DE LOS PRODUCTOS

estudios que involucran

AFLP (Polimorfismos de fragmentos de

AFLP (Polimorfismos de fragmentos de

16S-23S ITS (Espaciador intergénico 16S-23S)

•En bacterias el operón ribosómico contiene los genes

•Entre éstos genes se encuentran los ITS que contienen

•La secuenciación del 16S-23S ISR en numerosas

•La mayoría de bacterias tienen múltiples copias del

16S-23S ISR (Espaciador intergénico 16S-23S)

•Además se trata de una región sin actividad

•Ello hace posible la utilización de esta región con

•De hecho, el análisis completo del 16S-23S ISR o de

16S-23S ITS (Espaciador intergénico 16S-23S)

ANÁLISIS DE SECUENCIA, SELECCIÓN DE REGIONES ESPECIE

CONSTRUCCIÓN DE DISEÑO Y SÍNTESIS DE INICIADORES

DETECCIÓN ESPECIE ESPECÍFICA

RANDOM AMPLIFIED POLYMORPHIC DNA (RAPD)

 Fragmentos amplificados por

 Amplifican fragmentos de 0.5-

 Distribución aleatoria a lo largo CONSTRUCCIÓN DE

SEQUENCE CHARACTERIZED AMPLIFIED REGION (SCARs)

 SCARs son fragmentos de DNA amplificados por

 Diseñados a partir de secuencias de nucleotidos

 Al utilizar iniciadores más largos se evita el

 Los SCARs han sido aplicados en estudios de mapeo

 Marcadores moleculares de loci, unidades repetidas

 Cuando se conoce la secuencia de nucleótidos que

 Alto nivel de polimorfismo, marcadores informativos

•Es una técnica alternativa al RAPD dado que se basa en

•Al igual que en el caso del RAPD es necesaria una

•Dentro de éste grupo de técnicas se encuentran el REP

•El ERIC son regiones de entre 124 y 127 pb que se

PODER DISCRIMINATIVO DE LAS TÉCNICAS DE TIPADO

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