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INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLGICAS

CONTROL BIOLOGICO DE MEDICAMENTOS

Identificacin de microorganismos especficos

PRESENTAMOS:
Corts Rodrguez Amrica Xanat
Snchez Cullar Celeste Viridiana
Morales Vargas Maria Analy

PRODUCTO FARMACEUTICO
NO ESTERIL
Aquel preparado que permite la presencia de una carga bacteriana en
cantidad limitada (de acuerdo a las especificaciones de la Farmacopea)

Contaminacin
De acuerdo a la NOM-059-SSA1-2015 es la presencia de entidades
fsicas, qumicas o biolgicas indeseables.

Reducir o
inactivar la
actividad
teraputica de
Principio Activo

Cambios en las
caractersticas
fsicas y
qumicas del
producto.

Contaminacin
de productos
farmacuticos

Puede afectar la
estabilidad o
inocuidad.

Ocasiona
infecciones o
enfermedades
al paciente.

Personal

Reactivos y
medios de
cultivo

Puntos
de
control

Equipo e
instalacin

Programa
de limpieza,
sanitizacin
e higiene

Ambiente,
procesos
separados

Staphylococcus aureus
Pseudomona aeruginosa
Escherichia coli
Salmonella typhimurium

Escherichia coli
Pseudomona aeruginosa

contaminacin fecal
del agua E. coli
contaminacin
cruzada
Agua contaminada

MGA 0571 LIMITES MICROBIANOS

Escherichia coli
Indicador de contaminacin fecal del agua,
de materiales o superficies que se
manejan durante la fabricacin.

Staphylococcus aureus
Su presencia indica contaminacin de
origen humano.
Puede producir infecciones graves en
humanos.

Salmonella sp.
Proviene del intestino de humanos o
animales infectados

Pseudomonas sp.
Pueden crecer en lquidos carentes de
materia orgnica.
Los productos contaminados pueden
presentar cambios fisicoqumicos con
deterioro en su composicin.

E. coli

Caracteristicas microscopica

Morfologia colonial

De todos los microorganimos especificos

MGA. 571 LIMITES MICROBIANOS

Mtodos de recuento
Promocin de crecimiento de los medios de cultivo
Evaluacin de la aptitud del mtodo de recuento
Controles negativos
Preparacin de los microorganismos de referencia
Prueba de aptitud d el mtodo de recuento en presencia del producto
Inoculacin y dilucin
Neutralizacin o eliminacin de la actividad antimicrobiana
examen del producto

Determinacin de microorganismos especficos

Promocin del crecimiento y caractersticas inhibitorias de los medios de
cultivo
Pruebas de aptitud del mtodo
pruebas de producto

MICROORGANISMOS ESPECFICOS
CEPAS DE REFERENCIA

Cuales son?
De acuerdo a FEUM

Medios de cultivo

Agar soya tripticasa (AST)

Cultivo de una amplia

variedad de
microorganismos de
acuerdo a los
requerimientos USP.

Frmula
Peptona de casena
Peptona de harina de soya
Cloruro de sorio
Agar
pH final 7.3 +/- 0.2

Agar sal manitol (SM)

Aislamiento selectivo de
estafilococos y para la
deteccin de
Staphylococcus aureus a
partir de muestras clnicas.

Frmula
Extracto de carne
bovina
Digerido pancretico de
casena
Digerido pptico de
tejido animal
Cloruro sdico
D-manitol
Rojo fenol
Agar
pH 7,4 0,2

Frmula
Peptona de casena

Agar Baird-Parker (BP)

Extracto de carne

Aislamiento y
recuento de
estafilococos
coagulasa positiva en
alimentos y otros
materiales de
importancia sanitaria

Extracto de levadura
Cloruro de litio
Agar
Glicina
Piruvato de sodio
pH final: 6.8 0.2

Microorganismos

Crecimiento

Apariencia

E. coli ATCC 25922

P. mirabilis ATCC
43071

Inhibido

--Colonias marrones sin zona clara u

opaca alrededor

S. aureus ATCC
25923

Bueno a
excelente

Colonias negras con borde incoloro,

convexas, rodeadas de una zona
opaca, con una zona clara externa.

S. epidermidis ATCC
14990

Escaso o
bueno

Colonias negras, de tamao irregular.

Zona opaca alrededor de la colonia
(no hay zona clara).

Bueno

Frmula

Agar Vogel-Johnson (VJ)

Triptena
Extracto de levadura

Manitol

Deteccin de
estafilococos coagulasa
positivo fermentadores de
manitol, a partir de
alimentos y otros
materiales de importancia
sanitaria y clnica.

Microorganismos
Escherichia coli ATCC
25922
Proteus mirabilis ATCC
43071
Staphylococcus aureus
ATCC 25923
Staphylococcus
epidermidis ATCC 14990

Fosfato dipotsico
Cloruro de litio
Glicina
Agar
Rojo de fenol
pH final: 7.2 0.2

Crecimiento

Caractersticas de las
colonias

Inhibido

---

Escaso
Bueno excelente
Bueno

Negras, sin zona amarilla

alrededor.
Colonias negras, rodeada
de una zona amarilla.
Negras, pequeas, sin
zona amarilla alrededor.

Frmula

Agar cetrimida (Cet)

Aislamiento selectivo
de Pseudomonas
aeruginosa y de otras
especies del gnero.

Peptona de
gelatina
Cloruro de
magnesio
Sulfato de potasio
Agar
Cetrimida
pH final: 7.2 0.2

Microorganismos

Crecimiento

Pseudomonas aeruginosa
ATCC 27853

Bueno - excelente

Escherichia coli ATCC

25922

Inhibido

Staphylococcus aureus
ATCC 25923

Inhibido

Agar Pseudomonas P (PsP)

Frmula
Peptona de gelatina

Aislamiento, la deteccin y
la diferenciacin de
especies de Pseudomonas
spp, en base a la
produccin de piocianina.

Sulfato de potasio
Cloruro de magnesio
Agar
pH final: 7.0 0.2

Cepa

Crecimiento

Produccin de
Fluorescena

Produccin de
Piocianina

P. aeruginosa

Bueno

P. fluorescens

Bueno

P. putida
P. mallei
P. stutzeri
S. maltophilia

Bueno
Bueno
Bueno
Bueno

+
-

B. cepacia

Bueno

Escherichia coli

Bueno

Pseudomonas agar F

selectivo y diferencial
Gram-negativa, aerbica

Aportan
Aportan los
los
nutrientes
nutrientes

Glicerina produccin de pigmentos

[fosfatos] estimula la produccin de fluorescena e inhibe la produccin de
piocianina y piorrubina.
Sullfato de magnesio favorece el crecimiento proporcionando iones esenciales

P. aeruginosa secreta una variedad de pigmentos como

piocianina (azul verdoso), fluorescena (amarillo
verdoso fluorescente) y piorrubina (rojo pardo)

Incubacin
Durante 18-24 horas a 35-37 C, en aerobiosis.
Si no se observa crecimiento, reincubar a 25-30 C, o dejar a 22 C y observar
diariamente hasta 7 das.

Siembra

cultivo puro de 18-24 horas tomar una colonia y estriar la superficie del medio.

Resultados

Agar verde brillante

Fundament
o
la fuente de nitrgeno,
vitaminas y minerales
mantiene el balance osmtico
los hidratos de carbono
fermentables
indicador de pH vira al amarillo cuando
hay produccin de cido a partir de la
fermentacin de azcares
agente selectivo

selectivo y diferencial

Siembra
- dilucin del material a investigar o cultivo previo en un medio de
enriquecimiento selectivo.

Incubacin
Incubar 24 horas a 35-37C.
Resultado
s
Bacterias que no
fermentan la lactosa y/o
sacarosa

Bacterias que fermentan la

lactosa y/o sacarosa

Agar Xilosa Lisina Desoxicolato

selectivo y diferencial

Inhibe gram +
Fermentada Moo entricos excepto de Shigella(diferenciacin de la
Diferenciacin
del grupo Salmonella
especie)
Inducen la produccin de cido por los coliformes
Sistema indicador de la formacin de cido sulfhdrico produciendo un precipitado
negro en el centro de las colonias

Siembra
el medio de cultivo en superficie, por estra cruzada.

Incubacin
24-48 horas de 35-37C.

Resultados

Agar sulfito de bismuto

Fundamento

Salmonella
typhi
y otros bacilos
entricos
selectivo

Nutrientes
Regulador
Indicador en la produccin de sulfuro de hidrgeno
Inhibidores

debe utilizarse
el mismo da de su preparacin

Siembra
Inocular por el mtodo siembra en superficie

Incubacin
por 48 horas aprox. a 35 C en ambiente aerbico

Resultados

Agar McConkey
Fundamento
Por fermentacin de la lactosa, disminuye el pH alrededor de
la colonia. Esto produce un viraje del color del indicador de pH
(rojo neutro), la absorcin en las colonias, y la precipitacin de
las sales biliares.
Los microorganismos no fermentadores de lactosa producen
colonias incoloras.
nutrientes
Carbohidrato fermentable
agentes selectivos que inhiben el
desarrollo de gran parte de la flora Gram
positiva

selectivo y diferencial
gram
negativas

Siembra
- Sembrar en superficie.
- Utilizando la tcnica de Pour Plate: sembrar 1 ml de muestra y
agregar aproximadamente 15 ml de medio de cultivo fundido y
enfriado a 45-50 C.

Incubacin
Durante 18-48 horas, a 35-37 C, en atmsfera aerbica

Resultad
os

Agar Eosina Azul de Metileno

Diferenciales

selectivo y diferencial

Nutrientes
Diferenciacin
regulador de pH
Inhibidores

Sacarosa

grupo
coliforme fermentarla con
ms
facilidad
que
la
lactosa.

Combina las frmulas de Holt-Harris y

Teague con la de Levine, para obtener un
mejor
rendimiento
en
el
aislamiento
selectivo
de
enterobacterias
y
otras
especies de bacilos Gram negativos

Siembra
En superficie, por estra cruzada a partir de un inculo poco denso, para
obtener colonias aisladas.
En profundidad, para favorecer el desarrollo de clamidosporas.

Incubacin
De 24 a 48 horas a 35-37 C, en aerobiosis.

Resultados

AGAR HIERRO TRIPLE ZUCAR (TSI)

PRINCIPIO: Determinar la capacidad de un microorganismo para
atacar un hidrato de carbono especifico incorporado en un medio de
desarrollo basal, con produccin de gas o sin ella con la
determinacin de la posible produccin de acido sulfhdrico.

Aportan los nutrientes

Sustrato para
la produccin
de acido
sulfhdrico

Hidratos de carbono
fermentable
Sustrato para la
produccin de acido
sulfhdrico

La fermentacin es un proceso que se lleva en condiciones aerbicas

(pico de flauta) y anaerbicamente (capa inferior).
El medio TSI contiene una cantidad limitante de glucosa y una
concentracin 10 veces mayor de lactosa. Las enterobacterias y las
fermentadoras de glucosa comienzan a fermentar esta azcar.
Una vez que se ha reducido toda la glucosa piruvato, este se
metaboliza por el ciclo de Krebs formando productos finales cidos.
La presencia de cidos se detectan por medio del indicador rojo de
fenol el cual vira de color amarillo en medio cido.

El medio permanece rojo cuando no se produce

la fermentacin de ninguno de los azucares.

Cuando el microorganismo fermenta la lactosa

y la sacarosa el acido producido es suficiente
como para virar de color amarillo.

Si el microrganismo solo fermente la glucosa, el

acido producido en el fondo acidifica el medio
en esa zona y se torna de color amarillo (Debido
a la baja concentracin de glucosa (0.1%),
metabolizan las peptonas alcalinizando la
superficie del medio)

FORMACIN DE

AGAR AZUFRE HIERRO MOVILIDAD (SIM)

Es un medio semislido destinado a verificar la movilidad, produccin de
indol y de sulfuro de hidrgeno en un mismo tubo.
Es til para diferenciar miembros de la familia Enterobacteriaceae.

FUNDAMENTO
Produccin de
Algunas bacterias son capaces de liberar azufre de los aminocidos
Tiosulfato reductasa
Bacterias (medio acido) + tiosulfato de sodio
(incoloro)

(incoloro) + citrato frrico de amonio

Sulfuro ferroso (pp negro insoluble)

Movilidad
Puede apreciarse en este medio, por la turbidez que producen alrededor de la puncin de siembra
Alguna limitacin en las bacterias aerobias estrictas, que slo crecen en superficie, la movilidad puede ser difcil de observar

Produccin de indol
El triptfano es un aa que puede ser oxidado por ciertas bacterias para originar 3 metabolitos : indol, escatol y indolacetico.
La formacin de indol se produce solamente en aquellos microorganismos capaces de fermentar los hidratos de carbono
(Reactivo de kovacs o Ehrlich)

Caldo Voges-Proskauer (VP)

La glucosa es metabolizada a acido pirvico el principal intermediario en la
glucolisis, este a su vez se metaboliza y da como resultado la produccin de
acetoina (acetil metil carbinol) el cual es oxidado a diacetilo el cual reacciona
con la peptona del medio para dar un color rojo.
Por la adicin de un indicador alfa naftol e hidrxido de potasio para
evidenciar la presencia de productos finales neutros.

Hidrato de
Carbono
fermentabl
e

Aporta
nutrientes
para el
desarrollo
bacteriano.

Agar Citrato de Simmons

Medio utilizado para la diferenciacin de enterobacterias, en base a
la capacidad de usar citrato como nica fuente de carbono y
energa. Algunas bacterias pueden obtener energa de fuentes
distintas de la fermentacin de los hidratos de carbono
nica
fuente de
carbono
nica
fuente de
nitrogeno

La extraccin de nitrgeno de las sales de amonio

producen amoniaco y se alcaliniza el medio virando el
indicador al alcalino.

Caldo con base rojo de fenol

manitol
Se basa en la capacidad de los microorganismos para fermentar
el manitol.

Carbohidrato
fermentable

Proporciona los
nutrientes
necesarios para
el desarrollo de
los
microorganismo
s

Rojo de fenol que vira de rojo a amarillo

Caldo soya tripticaseina

Formula en gramos por
litro
Digerido pancretico de
casena

17.0 g

Digerido pancretico de soya 3.0 g

Cloruro de Potasio

5.0 g

Fosfato dibasico de potasio

2.5 g

Glucosa

2.5 g

Agua purificada

1000 mL

Ph despus de esterilizar

7.3 0.2

Prueba De Coagulasa

1:3
Suero de
conejo o
caballo

1 mL

S. aureus

37C
Observar cada:
2, 4 y 24 H.

Prueba de la Catalasa

La catalasa es una enzima que poseen la mayora de las bacterias

aerobias. Descompone el perxido de hidrgeno en agua y oxgeno.

Burbujas

1. Colocar una gota de perxido 3% sobre

un portaobjetos.

2. Suspender la bacteria con una asada

3.Detectar la formacin de burbujas

Prueba de oxidasa
Prueba utilizada para la deteccin de la enzima citocromo-c-oxidasa,
presente en los gneros Pseudomonas, Neisseria, Moraxella, Vibrio,
Aeromonas, entre otros.

FUNDAMENTO
Los discos contienen oxalato de dimetil-para-fenilendiamina, el cual
es el sustrato de la enzima oxidasa.
Los microorganismos que producen la enzima oxidasa se
evidencian porque en presencia de oxgeno atmosfrico y citocromo
c, se oxida el sustrato presente en los discos a un compuesto de
color rojo-fucsia.

Metodologa
Prueba

Agar hierro triple azcar

(TSI)

Agar azufre hierro

movilidad (SIM)

Sembrar por picadura ,

incubar 37 C por 24 hrs
Indicador rojo fenol.

Sembrar por picadura ,

incubar 37 C por 24
hrs
Produccin de indol: 35 gotas de reactivo de
Kovacs o Ehrlich

Caldo Voges Proskauer

Inoculacin directa, en
anaerobiosis 35-37C por 3 das.
Aadir 0,6 ml de alfa naftol al 5%
y 0.2 ml de hidrxido de potasio
al 40% a 2.5 ml de cultivo.
Agitar vigorosamente el tubo, y
dejar a temperatura ambiente
durante 10-15 minutos. Observar
el color de la superficie del medio.

Agar Citrato de Simmons

Estriar la superficie,
incubar en aerobiosis
37 C por 24 hrs.

Caldo con base rojo de

fenol manitol

Inoculacin directa,
35-37

Caractersticas morfolgicas

Resultados de pruebas
Bioquimicas