UNIVERSIDAD NACIONAL DE PIURA

ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERA QUMICA

LABORATORIO DE QUMICA
EXPERIMENTAL E INVESTIGACIN

CURSO DE CROMATOGRAFA LQUIDA

DE ALTA PERFORMANCE-HPLC
COMISIN ENCARGADA DE IMPLEMENTACIN DEL
REA DE INVESTIGACIN-LQEI-UNP
ING. BRUNO J. CHUNGA PURIZACA
ING. ALFREDO FERNANDEZ REYES
ING. KARINA L. LOZADA CASTILLO

AUSPICIA:

 QU ES LA CROMATOGRAFA ?
MICHAEL

TSWETT

REALIZ

LA

PRIMERA

SEPARACIN EN COLUMNA DE PIGMENTOS DE

CLOROFILA,

LLAMANDO

SU

MTODO

CROMATOGRAFA
ES UN MTODO DE SEPARACIN DE ESPECIES
QUMICAS PARAIDENTIFICARLAS CUALITATIVA O
CUANTITATIVAMENTE.
J. Chem. Ed. 36, 144, 1959
J. Chem. Ed. 44, 235, 1967

ELUYENT
E
(FASE
MVIL)

COLUMNA O
PLACA
(FASE
ESTACIONARI
A)

ELUATO

Qu es la
Cromatografa?
Es un mtodo de separacin de mezclas
en sus constituyentes individuales
Tiene dos finalidades:

Purificacin

Anlisis

MEDICINA DEL
DEPORTE
ANTI-DOPING

FARMACOLOGA

CROMATOGRAFIA

INVESTIGACIN
QUMICA Y
BIOQUMICA
INVESTIGACIN
EXTRATERRESTRE

POR QU SE LLAMA
CROMATOGRAFA?
KHROMATOS
(Color)

GRAPHOS
(Escritura)

MIGUEL TSWEET (BOTANICO RUSO-1906). REALIZO LA PRIMERA

CROMATOGRAFA EN COLUMNA.
Eter de
petrleo

Eter de
petrleo

Mezcla de
pigmentos
vegetales
CaSO4

Eter de
petrleo

Inicios de la
Es una tcnica de separacin basada en la diferente
Cromatografa
velocidad con que se mueven los solutos a travs de un
medio estacionario mediante el flujo en un disolvente
llamado eluente o fase mvil.
F. F. Runge qumico alemn, describi el proceso de
separacin que actualmente se conoce como
cromatografa en papel.
El ruso Mijail Tswett corresponde el haber establecido las
ventajas de la cromatografa y la adopcin parcial de la
terminologa, tambin fue quien sent las bases de los
principales procedimientos experimentales relativos a
sta tcnica.

Inicios
A pesar de que el mtodo

cromatogrfico prometa
simplificar la separacin
de sustancias de mezclas
complejas, no fue sino
hasta finales de la dcada
de los 30 y principios de
los 40 cuando se empez
a
desarrollar
la
tcnica
teniendo este mtodo
diversas aplicaciones.

Las nicas sustancias

que no pueden ser

examinadas por
cromatografa son las
insolubles y aquellas que
se descomponen con el
solvente o con la fase
estacionaria.

SLO EL 20% (APROX.) DE LOS COMPUESTOS CONOCIDOS

PERMITEN SER ANALIZADOS POR CROMATOGRAFA DE GASES.
LIMITADA POR VOLATILIDAD E INESTABILIDADTRMICA

LA

HPLC (CROMATOGRAFA DE LQUIDOS DE ALTO RENDIMIENTO,

HIGH

PERFOMANCE

LIQUID

CHROMATOGRAPHY)

SEPARAR

MACROMOLCULAS,

PRODUCTOS

NATURALES,

ESPECIES

POLMEROS,

PUEDE
INICAS,

PROTENAS,

ETC.

USANDO FASES MVILES LQUIDAS

LA

HPLC

PRESENTA MAYOR

ESTACIONARIAS QUE LA CG.

VARIEDAD

DE

FASES

Mtodos:
M TO D O S CRO M A TO GR FICO S
SIM PLES
PA PEL

PLA CA

IN STRU M EN TA LES
CO LU M N A

GASES

LQ U ID O S

 QU TIPOS DE ES LA CROMATOGRAFA
EXISTEN?

CLASIFICACIN PRINCIPAL:
CROMATOGRAFA EN COLUMNA
CROMATOGRAFA EN PAPEL Y CAPA FINA

TIPOS DE CROMATOGRAFIA:
1. Cromatografa de Capa Fina (Thin-layer
Chromatography - TLC).
2. Cromatografa de Alta Performance en Capa Fina
(High performance Thin-layer Chromatography HPTLC).
3. Cromatografa de Columna (Column
Chromatography).
4. Cromatografia de Gases (Gas Chromatography - GC).
5. Cromatografia Lquida de Alta Performance (High
performance liquid Chromatography - HPLC).
6. Cromatografia de Fluido Supercrtico (Supercritical
Fluid Chromatography - SFC).
7. Electroforesis Capilar (Capillary electrophoresis - CE).

LA INFORMACIN QUE NOS PROPORCIONA

EL CROMATOGRAMA
PARMETROS A CONSIDERAR
1.GASTO: RAPIDEZ DE LA FASE MOVIL EN UNA
COLUMNA (mL/min)

2.TIEMPO DE RETENCIN tRI: TIEMPO QUE

TOMA

AL

CUALQUIER

ELUYENTE
COMPONENTE

TRANSPORTAR
HASTA

EL

DETECTOR ANCHO DE PICO EN LA BASE WI:

DISTANCIA

DE

LA

PROYECCIN

DE

DOS

TANGENTES A LOS PUNTOS DE INFLEXIN.

3.ALTURA DE PICO hi
4.ANCHO TOTAL A LA MITAD DEL PICO FWHM

TIEMPO NETO DE RETENCIN (PICOi ) = tRitM

FACTOR DE RETENCIN O DE CAPACIDAD(PICOi ) ki= tRitM / tM

ELEMENTOS BSICOS DE LA
CROMATOGRAFA
Fase estacionaria (Fija)
Slida: Slica gel, almina,etc.
Lquida: Solventes polares, no polares, y mixtos.

Fase mvil (Se desplaza)

Lquida: Solventes polares, no polares y mixtos.
Gaseosa: Gas inerte (Nitrgeno, helio, etc. )

Columna

Fase
Mvi
l

Inyeccin

Compuestos

Migracin

Elucin

Proceso de las separaciones

cromatogrficas
Fase mvil

Es la distribucin de
los constituyentes de
una mezcla entre la
fase estacionaria y la
fase mvil.

Fase
estacionaria

Fase mvil

Algunas sustancias son retenidas ms fuertemente en

la fase estacionaria por:
Su mayor polaridad, lo que favorece su adsorcin
en dicha fase.
La menor solubilidad en la fase mvil.
Otras sustancias son menos retenidas, debido a:
Su menor polaridad, lo que disminuye su
capacidad de adsorcin en la fase estacionaria.
Su mayor solubilidad en la fase mvil

Clasificacin de la
cromatografa
Esta tcnica analtica se clasifica de acuerdo a
su mecanismo de separacin en cromatografa
de:
Reparto
Adsorcin
Exclusin.
Intercambio inico
Cromatografa de afinidad

Cromatografa de
Reparto
Usa una fase
estacionaria lquida que
forma una fina pelcula
sobre la superficie de
un soporte slido.
El soluto est en
equilibrio entre el
lquido estacionario y la
fase mvil

La fase mvil puede ser

un lquido o un gas
segn sea el caso de la
cromatografa; en caso
de que la cromatografa
sea lquido / lquido la
fase mvil ser un
liquido, o de un gas en
cuyo caso es
cromatografa gas/
lquido.

El soluto se disuelve en
la fase lquida con que
est recubierta el
soporte slido

CROMATOGRAFIA DE
REPARTO O PARTICIN
1.Fase estacionaria:
Lquido sostenido o
adsorbido en un slido
inerte.
2.Fase mvil:
Lquido (CLL)
Gas (CLG)
Nota: Los lquidos de las 2
fases deben ser inmiscibles
entre s.

CROMATOGRAFA DE
ADSORCIN
El soluto se adsorbe sobre las
Usa una fase

estacionaria slida y
una fase mvil lquida
o gaseosa
Fase estacionaria: slido.
Fase mvil:

Lquido ( CSL)
Gas (CSG)

superficie de las partculas

slidas, la separacin se
explica con la desercin de
sustancias contenidas en la
fase mvil sobre un slido
estacionario
Pueden
ser
sistemas
lquido/slido y gas/slido. En
cualquier
fenmeno
de
adsorcin
influyen
tres
variables:
Adsorbente,eluente y solutos.

CROMATOGRAFA DE
ADSORCIN
El trmino adsorcin en el contexto

cromatogrfico se refiere a interacciones dbiles.

CROMATOGRAFA DE
ADSORCIN
Cromatografa lquido/

Cromatografa gas /slido:

slido: la fase
estacionaria suele ser gel de
slice , almina, carbn
activado y polvo poliamida.
Algunas veces al aplicar
almina pueden ocurrir
cambios qumicos, es decir,
quimisorcin durante el paso
del soluto por la fase
estacionaria.

los adsorbentes mas

usados son: almina, gel de
slice, carbn activado y
mallas moleculares. Se
realizan en columna.
El material que sea utilizado
como adsorbente debe
presentar una estructura
rgida, tamao uniforme y
ser qumicamente inerte.

CROMATOGRAFA DE
EXCLUSIN
La separacin est basada en los diferentes

volmenes moleculares de los solutos.

El tiempo de elusin es proporcional al peso
molecular de los mismos, lo que provoca ser no muy
usada con compuestos de alto peso molecular.
Principalmente en este proceso se emplean geles
no inicos de partculas uniformes y porosos, como
fase estacionaria.

Tambin llamada de
filtracin por gel o de
permeacin
gel.las molculas
Separa molculas porpor
su tamao,
grandes pasan ms rpido que las pequeas, no
hay una interaccin entre la fase estacionaria y
el soluto, sino que la fase mvil pasa a travs de
un gel poroso.
Los poros pequeos dejan pasar a las
molculas grandes y las molculas pequeas
tardan ms tiempo en pasar a travs de la
columna.

Se excluyen
las molculas
grandes

Cromatografa de
intercambio inico
Los aniones mviles
permanecen cerca de los
cationes que estn
covalentemente unidos a la
fase estacionaria

Resina catinica, que solo

fija aniones.

Cromatografa de
Afinidad
Es la ms selectiva, emplea interacciones de

molculas de un soluto en particular y una segunda

molcula que est unida covalentemente
(inmovilizada) a la fase estacionaria.
La molcula inmovilizada podra ser un anticuerpo
unido a una protena determinada.
Solo la protena que reacciona con el anticuerpo se
fija en la columna.

Cromatografa de
Afinidad
Todas las dems molculas se eliminan

Una clase
especfica de
molculas, se une
a la fase
estacionaria

Disolventes
comnmente
Pentano
utilizados
Ciclohexano
Dioxano
Benceno
ter etlico
Cloroformo
Cloruro de metileno
Acetona
Etanol
Metanol
Agua

POLARIDAD

Aspectos fsicos de la
Cromatografa
La velocidad lineal de flujo, nos dice cuntos cm
recorre el disolvente dentro de la columna en un
minuto.
Cromatograma, es un grfico que representa la
respuesta del detector en funcin del tiempo de
elucin.
Tiempo de retencin tr, de un componente es el
tiempo necesario despus de la inyeccin de una
mezcla en la columna hasta que ese componente
llegue al detector.

Aspectos fsicos de la
Cromatografa
Volumen de retencin

Vr, el volumen de la
fase mvil necesario
para eluir un soluto
determinado
de
la
columna.
Eluyente, fluido que
entra por la columna.
Eluato, fluido que sale
por el extremo de la
columna.(efluyente)

Coeficiente de reparto,

o particin, si K es la
constante de la reaccin:

S en la fase 1 S en la fase 2

S 2
K
S 1

Aspectos fsicos de la
Cromatografa
Coeficiente de distribucin D, se define

como:

concentracin total de la fase 2

concentracin total de la fase 1

En general, los cocientes de particin

y distribucin se asocian a la fuerza de

retencin de los diferentes componentes
del soluto por la fase estacionaria

Aspectos fsicos de la
Cromatografa

Coeficiente de difusin, mide la velocidad a

que se mueve al azar una sustancia desde una

regin de mayor concentracin a otra de menor
concentracin.
Altura de plato, es la constante de
proporcionalidad entre la varianza(s) de la banda
y la distancia que ha recorrido (x).Cuanto ms
pequea es la altura de un plato, ms estrecha
es la banda.

Eficacia de la separacin
Diferencia

de tiempos de elucin de los

respectivos picos, cuanto ms distantes sean
mejor.
Anchura de los picos, cuanto ms anchos sean
los picos, peor la separacin.

Resolucin = 0.75

Seal

Seal

Resolucin = 0.50

tiempo

tiempo

Resolucin = 1.50

Seal

Seal

Resolucin = 1.00

tiempo

tiempo

Cromatografa lquida.
Y Cromatografa de lquidos de alta eficacia
Fase mvil, lquido a alta presin
Fase estacionaria slido en columnas de un

dimetro de 3 a 10 micras.
Analito: lquido.
Utiliza instrumentacin especializada.
http://kerouac.pharm.uky.edu/ASRG/HPLC/HPLC
MYTRY.HTML

Cromatografa de lquidos
en columna
Sentido de flujo

A+B

A+B
2

Cromatografa de lquidos
en columna
Sentido de flujo
3

Cromatografa de lquidos
en columna
Sentido de flujo
Tiempo

Diafragma
de
inyeccin
de muestra

Columna

Detector

Registrador

COMPONENTES BASICOS PARA UN SISTEMA

DE CROMATOGRAFA DE LQUIDOS
RECIPIENTE PARA
ELUYENTE
FILTRO
INYECTOR
GUARDA (COLUMNA
DE SEGURIDAD)

COLUMNA
ANALTICA

BOMBA

CONTROL DE
LA BOMBA

DETECTOR

COMPUTADORA
(ANLISIS DE
DATOS)

CROMATOGRAFA DE LQUIDOS
LA GUARDA O COLUMNA DE SEGURIDAD SE COLOCA
ENTRE EL SISTEMA DE INYECCIN Y LA COLUMNA
ANALTICA.
GUARDA

SE USA PARA AUMENTAR EL TIEMPO DE VIDA DE LA

COLUMNA ANALTICA REMOVIENDO IMPUREZAS Y

COLUMNA
ANALTICA

COMPUESTOS QUE DAEN LA COLUMNA.

CONTIENE LA MISMA FASE ESTACIONARIA QUE LA
COLUMNA ANALTICA.
SE DEBE CAMBIAR DEL SISTEMA CON REGULARIDAD

COLUMNAS Y TIPOS DE SEPARACIN

MANUFACTURADAS USANDO ACERO INOXIDABLE
SE FABRICAN EN UNA AMPLIA VARIEDAD DE
DIMETROS INTERNOS Y LONGITUDES

VENTAJAS DE LA CROMATOGRAFIA
1. Anlisis Simultneos.
2. Alta Resolucin.
3. Alta Sensibilidad (rangos de
concentraciones a niveles de ppm ppb)
4. Pequeos Volmenes de Inyeccin
(de 1 a 100 uL).

Cromatografa Lquida
de Alta Performance
HPLC

Ventajas de la Cromatografa Lquida de Alta

Performance - HPLC
Condiciones de Anlisis Moderadas (solo
cerca del 20 % de los compuestos
orgnicos conocidos pueden ser
analizados por Cromatografa de Gases sin
tratamiento previo).
Fcil de fraccionar y purificar la
muestra.
Muy Buena Repetibilidad
(Coeficiente de Variacin menor al 1 %).

Cromatografa Lquida de Alta Performance - HPLC

Como es que ocurre la separacin en
Cromatografa?
La separacin ocurre por migracin
de los anualitos en mezcla a
diferentes velocidades.
La velocidad de migracin esta
gobernada
por
diferentes
interacciones
entre
un
Soluto
(conducido por un lquido en
movimiento) y el Absorbente (slido
o lquido).
El Lquido se denomina Fase Mvil
y el Absorbente Fase Estacionaria.

Cromatografa Lquida de Alta Performance - HPLC

Como es que ocurre la separacin en Cromatografa?
La Fase Estacionaria.Por lo general esta constituida
por un slido poroso, con un
tamao de partcula muy
pequeo, de superficie inerte.
Este slido esta recubierto por
una pequea capa o pelcula
de un lquido.
La Fase Mvil.Es un solvente de alto grado
de pureza o una mezcla de
ellos.

Cromatografa Lquida de Alta Performance - HPLC

Como es que ocurre la separacin en Cromatografa?

Cromatografa Lquida de Alta Performance - HPLC

Como es que ocurre la separacin en
Cromatografa?
Como se ha podido
observar, la separacin
ocurre como resultado
de la diferencia de
interaccin entre los
analitos y la fase
estacionaria.
t1 < t2

Cromatografa Lquida de Alta Performance - HPLC

Que es un Cromatograma?
Un Cromatograma es el registro
de los componentes de una
mezcla (en forma de un Pico y
en funcin del tiempo). Los
componentes
en
mezcla
(separados por la columna),
pasan a travs de un detector, el
cual registra la seal de cada
componente en forma de un pico.

Cromatografa Lquida de Alta Performance - HPLC

Que caractersticas presenta un Cromatograma?
Un Cromatograma debe de
presentar Picos de forma
simtrica y bien definidos.
Debe de presentar alturas de
Pico dentro de la escala de
registro.
Debe de tener una lnea base
consistente.
No debe de presentar bandas
anchas.

Para obtener Picos bien

definidos deben de
controlarse una serie de
factores, en caso
contrario ocurrirn los
ensanchamientos de
bandas.

Cromatografa Lquida de Alta Performance - HPLC

Que Factores causan el ensanchamiento de Bandas?
Son 4 los principales factores que
causan el ensanchamiento de bandas:
1. Difusin de Eddy (principal causa
ensanchamiento de Banda).
2. Distribucin de Flujo (cuando el flujo en
el centro del canal es ms rpido que en el
rea de las partculas).
Para reducir el ensanchamiento de banda
debido a estos dos factores, el empaque
de la columna debe de tener un tamao de
partcula tan cercano a la distribucin de
esta, tanto como sea posible.

Cromatografa Lquida de Alta Performance - HPLC

Que Factores causan el ensanchamiento de Bandas?
3.- Difusin de la Muestra Molecular en la Fase Mvil.
Este factor es importante si:
El tamao de la fase estacionaria es pequea (< 10mm).
La velocidad de la fase mvil es lenta.
(La velocidad de flujo de la fase mvil debe de escogerse de
tal
forma que la difusin longitudinal no cause efectos
adversos).

Cromatografa Lquida de Alta Performance - HPLC

Que Factores causan el ensanchamiento de Bandas?

Difusin de la Muestra Molecular en

la Fase Mvil.
Este ocurre cuando:
m > 2Dm/dp
Donde:
m = Velocidad Lineal
dp = Diametro de la Partcula.
Dm = Coeficiente de Difusin
Dm = 7.4 x 10-12 MT
x Vs0.6

Cromatografa Lquida de Alta Performance - HPLC

Que Factores causan el ensanchamiento de Bandas?
4.- Transferencia de Masas entre la Fase Mvil (Fase
Mvil Extraa) y la Fase estacionaria.
Para prevenir esto:
Deben de utilizarse partculas pequeas (o de pelculas
delgadas) o superficies porosas como fase
estacionaria.
Deben de utilizarse solventes de baja viscosidad.
Alta razon de anlisis puede obtenerse a expensas de la
resolucin y viceversa.
Estructura Porosa de una
Partcula de la fase estacionaria

Cromatografa Lquida de Alta Performance - HPLC

Que informacin me da un Cromatograma?
Un Cromatograma nos da dos tipos de informacin:
1.
Informacin Cualitativa: El Tiempo de
Retencin, casi siempre es constante bajo las
mismas condiciones cromatogrficas. Esto nos
sirve como un parmetro de identificacin de
sustancias.
2.
Informacin Cuantitativa: El rea del Pico de
cada
componente
es
proporcional
a
la
concentracin del componente en la mezcla, y este
valor es utilizado para realizar clculos de
concentracin.

Cromatografa Lquida de Alta Performance - HPLC

Que informacin me da un Cromatograma?
Un Cromatograma tambin puede utilizarse
para evaluar la eficiencia de separacin y la
performance de la columna.
Los Principales Parmetros de evaluacin son:
Factor de Capacidad: k.
Selectividad: a
Nmero de Platos Tericos: N
Platos Tericos Equivalentes: HETP
Resolucin: Rs

Factor de Capacidad (k)

Que es el Factor de Capacidad?
El Factor de Capacidad es un valor numrico que nos
indica el grado de separacin que puede tener una
columna en funcin del volumen retenido de un analito y
el volumen retenido del solvente. El factor de capacidad
se expresa en funcin del volumen por que:
El tiempo de retencin, depende de la razn de flujo y
las dimensiones de la columna, por ello no es un valor
apropiado para la comparacin de Cromatogramas.
El Factor de Capacidad, es independiente de la razn de
flujo y de las dimensiones de la columna.
El valor de el Factor de Capacidad, utilizando razones
de Volumen por lo general debe de oscilar entre 1 a 5
(preferentemente).

Factor de Capacidad (k)

Vr = Volumen de Retencin
del Pico de un Soluto.
V0 = Volumen del Solvente
(Pico no retenido)
El tiempo de Retencin puede
utilizarse para fijar el
Volumen de Retencin.

Factor de Capacidad (k)

Factor de Capacidad (k)

Selectividad ()
Que es la Selectividad?
La Selectividad es un
coeficiente que indica el
grado de separacin de
dos picos.

Selectividad ()
Debe de tenerse en cuenta que :
1.
Dos componentes no pueden ser
separados si el factor de capacidad (k) es
exactamente el mismo para ambos.
2. El aseguramiento de esta diferencia es por la
selectividad (la separacin es imposible si =
1).
3. La Selectividad se ve afectada por la eleccin
de la Fase Mvil y la fase Estacionaria.

El nmero de Platos Tericos (N)

Que es el Nmero de Platos Tericos?
El Nmero de Platos Tericos, es un ndice
numrico que nos indica el grado de eficiencia
de la columna cromatogrfica.

Columna con buena eficiencia,

alto valor de N

Columna con pobre eficiencia,

bajo valor de NN = 15000

El nmero de Platos Tericos (N)

Que es el Nmero de Platos Tericos?
Cromatograficamente, el nmero de Platos Tericos
es la relacin entre el tiempo de retencin del soluto y
el ancho de la banda del mismo (el incremento del
ancho del pico del analito).
Consideraciones:
Los picos de los analitos deben de ser simtricos y
de bandas delgadas.
Los Picos de los analitos que presenten bandas
anchas y que adems se encuentren muy cercanos
entres si no podrn ser resueltos y sern co-eluidos.

El nmero de Platos Tericos (N)

Matemticamente y en funcin de los
siguientes parmetros cromatogrficos:
El nmero de Platos Tericos
se expresa como:
Ecuacin Original:
N = 16 x (tr / W )2
Ecuacin Modificada para las
mediciones actuales:
N = 5.54 x ( tr / W1/2 )2
Ecuacin Modificada para el
integrador:
(nicamente si la forma de los Picos
N = 6.28 x (tr x H / rea)2
son del tipo Gaussiana).

Altura Equivalente a un Plato Terico

(HETP)
Que es una HETP?
Una altura Equivalente a un Plato Terico es otro ndice
numrico que nos indica el grado de eficiencia de la
columna cromatogrfica.
Matemticamente se expresa como:
HETP = L / N
L = Longitud de la Columna
N = Nmero de Platos Tericos
El valor de una HETP se traduce como el Plato Terico
mas corto que puede colocarse dentro de la longitud de
columna. Esto significa que mientras mas pequeo sea
una HETP, podemos colocar mas HETP y la eficiencia
de la columna ser mayor.

Altura Equivalente a un Plato Terico

(HETP)
Comentarios:
La Altura Equivalente a un Plato Terico se
relaciona con la Velocidad de Flujo Lineal de La
fase Mvil.
Cada Columna tiene un Flujo de Fase Mvil
ptimo.
Para obtener una buena eficiencia con las
columnas, los siguientes valores de flujo de
fase mvil son los preferibles:
4.0 mm ID
4.6 mm ID
6.0 mm ID

0.6 mL/min
0.8 mL/min
1.0 mL/min

Resolucin (Rs )
Que es la Resolucin?
La Resolucin es un ndice numrico que nos
indica el grado de separacin de dos
compuestos. Esta puede expresarse utilizando
los siguientes parmetros:
Matemticamente esta
se expresa como:

Resolucin (Rs )
Que pasa si es que dos picos se
superponen?
Cuando dos picos se superponen, no puede
hacerse la determinacin
utilizando la ecuacin anterior. Para ello la
ecuacin se ha modificado
utilizando el ancho del pico a la mitad de la altura:

Resolucin (Rs )
Que es la Resolucin?
Otra forma de calcular este ndice es en base al
Nmero de Platos Tericos (N), la Selectividad
() y el Factor de Capacidad (k):

N : Promedio de N1 y N2
k : Promedio de k'1 y k'2

Resolucin
Si los picos fueran de forma Triangular, dos
picos pueden ser separados con un valor de
Resolucin igual a 1.

Sin embargo, los picos se presentan en

formas Gaussianas

Resolucin
Que tanto deben de estar resueltos dos picos?
La Resolucin mnima requerida para realizar cualquier
trabajo Cromatogrfico es de 1.25
La Separacin de la Lnea Base del Pico Cromatogrfico
se lleva a cabo cuando Rs tiene un valor de 1.50

Resolucin
De que depende la Resolucin?
La Resolucin es una funcin
de:
1.Selectividad de la Columna
2.Eficiencia de separacin de
la Columna.
3.El Factor de capacidad.

Resolucin
Por ejemplo:

Resolucin
Y ... Como llevo a cabo
estos cambios?

Para Incrementar N
Utilizar una columna ms grande
o una columna de mejor
performance.
Para incrementar k
Disminuir el contenido de un
solvente orgnico para columnas
ODS.
Cambiando
Cambiar el contenido orgnico,
pH u orden del solvente orgnico
o cambiar la temperatura de la
columna.

Resolucin
Para mejorar la Resolucin podemos ...
1. Ajustar la razn de flujo a un nivel ptimo.
2. Ajustar la Temperatura de la columna
(debe de tenerse en cuenta que el
incremento de la temperatura en la columna
acorta el tiempo de vida de la misma).

Resolucin
Razn Pico -rea
Rs

1:1

1:3

1:10

1:30

1:100

0,8

5,90%

5,00%

(*) %

(*) %

(*) %

2,30%

2,60%

2,70%

2,90%

(*) %

1,2

0,83%

1,10%

1,40%

1,60%

1,80%

1,4

0,26%

0,41%

0,49%

0,71%

0,92%

1,6

0,07%

0,10%

0,16%

0,22%

0,33%

1,8

0,02%

0,02%

0,03%

0,05%

0,09%

0,00%

0,01%

0,01%

0,01%

0,02%

2,2

0,00%

0,00%

0,00%

0,00%

0,00%

(*) Aparece un pequeo pico, pero como un pequeo hombro.

MUCHAS GRACIAS