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TIPOS DE PCR
PCR simples:
utiliza-se um par de primers, que limitam a
regio do DNA a ser amplificada >> 1 amplicon
TIPOS DE PCR
PCR multiplex:
so utilizados dois ou mais pares de primers
para amplificar diferentes regies do genoma
de
um mesmo organismo, ou genomas de
diferentes organismos
2 primers
(duplex)
2 amplicons
TIPOS DE PCR
PCR Nested:
duas reaes de PCR consecutivas >> maior
sensibilidade
1a etapa: PCR simples utilizando um par de primers
externo
TIPOS DE PCR
RT-PCR:
utilizada quando o molde a ser amplificado uma
molcula de RNA.
1a etapa: sntese de um cDNA a partir do RNA alvo, por
ao da enzima transcriptase reversa
TIPOS DE PCR
RealTime-PCR (PCR em tempo real):
permite a quantificao do DNA alvo (ou RNA,
quando acoplada a uma reao de transcrio reversa)
TCNICAS MOLECULARES
QUE UTILIZAM A PCR
PCR-RFLP
(Restriction
Fragment
Length
Polymorphism Polimorfismo do tamanho do
fragmento de restrio)
RAPD (Random Amplification of Polymorphic DNA
amplificao randmica de DNA polimrfico- utiliza
1 primer com sequncia arbitrria, e portanto sua
sequncia alvo desconhecida.
(1) Obteno de fingerprints (impresses digitais)
genmicos de indivduos, variedades e populaes;
(2) Anlise da estrutura e diversidade gentica em
populaes naturais;
(3) Estabelecimento de relacionamentos filogenticos
entre diferentes espcies;
PCR-RFLP
AMPLIFICAO SEGUIDA DE DIGESTO COM
ENZIMAS DE RESTRIO
PCR-RFLP
Stio de restrio
DNA alvo
Amplicon
Fragmento 1
Fragmento 2
Medicina
Forense
345pb
322pb
A mutao pontual na
regio 3 no traduzida
com substituio de uma
guanina por uma
adenina no nucleotdeo
20210 (20210 GA)
resulta numa molcula
de RNA mais estvel,
resultando em aumento
da produo de
protrombina,
favorecendo a formao
163
267
200
163
67
67
37
37
NN NN
NL NN
Variante Leiden:
Angiotensina
I
ECA
Polimorfismo:
I (insero) / D (deleo)
Regio de Amplificao do
Gene da ECA
1441
1501
1561
1621
1681
1741
1801
1861
1921
1981
2041
2101
TGAGACCCTG
CCCTCACAGG
TGTAAGCCAC
ATACAGTCAC
GCAGTGGCGG
CCTCAGCCTC
TATTTTTAGT
CGTGATCCGC
TTATGTGGTT
GAGGTGAGCT
ATGGCCACAT
GCGGGGAGAG
Alelo I
Alelo D
TCTCAGAAAG
ACTGCTGAGG
TGCTGGAGAC
TTTTTTTTTT
GATCTCGGCT
CCAAGTAGCT
AGAGACGGGG
CCGCCTCGGC
TCGCCAATTT
AAGGGCTGGA
CCCGGAAATA
CCATCCTCCA
AAAAAAAAAA
CCCTGCAGGT
CACTCCCATC
TTTTTGAGAC
CACTGCAACG
GGGACCACAG
TTTCACCGTT
CTCCCAAAGT
TATTCCAGCT
GCTCAAGCCA
TGAAGACCTG
GTTTTACCCG
AAAAAGGAGA
GTCTGCAGCA
CTTTCTCCCA
GGAGTCTCGC
TCCGCCTCCC
CGCCCGCCAC
TTAGCCGGGA
GCTGGGATTA
CTGAAATTCT
TTCAACCCCC
TTATGGGCAT
AAATACGTGG
GGAGAGAGAC
TGTGCCCAGG
TTTCTCTAGA
TCTGTCGCCC
GGGTTCACGC
TACGCCCGGC
TGGTCTCGAT
CAGGCGTGAT
CTGAGCTCCC
TACCAGATCT
GGGAGGGCTG
AACTCATCAA
TCAAGCACGC
CCGGGGACTC
CCTGCTGCCT
AGGCTGGAGT
CATTCTCCTG
TAATTTTTTG
CTCCTGACCT
ACAGTCACTT
CTTACAAGCA
GACGAATGTG
GCGAGACAAG
CCAGGCTGCC
480pb
PD
PD
PR
PR
190pb
Amplificao do segmento
do gene da ECA
500bp
480bp
300bp
200bp
190bp
100bp
DD
DD DD ID
II
ID ID
ID
ID
C-
PESQUISAS DE
AGENTES
INFECCIOSOS
>> GENOMA DE DNA
>> GENOMA DE RNA
Pesquisa de Citomegalovrus:
genoma de DNA
pode estar em pequena quantidade na amostra
>>> PCR-nested
alvo o gene MIE
caagcgtcac
tccataaata
aatattttct
gccgccatgg
aactctatat
cgGGCCttag
agctccttaa
tacatgctct
tctaagatat
ttctcttccg
tagtgacctt
tgtgatcaat
gggcataagc
cctgactgca
tcctgtagca
cctgcagtgc
tacaagccat
gcatagttag
ctaaggcatt
tctgggtata
gtactcatta
gtgcgtgagc
cataatctca
gccattggtg
catatacatc
accccccaac
ccacatctcc
cccaatacac
ctgcaaacat
ttttttcagc
cacattgttt
accttgtctc
tcaggggagc
gtcttaggga
atctttctcc
ttgttagcGG
cgcttatcct
ttcatctcct
cctcccatca
atgtgctcct
ccacacatgt
tctcctcatc
actgaggcaa
aggctgagtt
taagttcatc
CGCCcttgct
caggtacaat
cgaaaggctc
tattaaaggc
tgattctatg
agtgaggata
caaaatctta
gttctgcagt
cttggtaaag
ctttttagca
cacatcatgc
gtagttctca
atgaacctta
gccagtgaat
ccgcaccatg
Amplificao do segmento do
gene MIE
A
amplificao feita em
duas reaes
consecutivas (nested-PCR) de acordo com a tcnica
padronizada no laboratrio (3).
Diagrama do Nested PCR para CMV
primer2
DNA alvo
primer1
primer4
1 PCR
Produto: 305pb
primer3
2 PCR
Produto: 146pb
305 pb
210 pb
146 pb
9 10 11