Efecto de Lactobacillus casei

Shirota, Bifidobacterium breve,

e inulina enriquecida con
oligofructosa sobre el
metabolismo de nitrgeno-
protena en colon en humanos
sanos.

(Preter y col., 2007)

BIOQUMICA AVANZADA
Luis Arturo Ruiz Galindo
Claudia Gamboa Gmez
Nancy Valadez Bustos
Anaguiven valos Soriano
Mara Alejandra Nuez Lpez
Alexandra Crdenas Hernndez
Claudia Snchez Ibarra
Eugenia Olivera Fox
Flor Gonzlez Catao
 Introduccin

1. Introduccin
 Introduccin

Probitico: Microorganismo vivos que se

adicionan a un alimento

Prebitico: Ingrediente no digerible que

estimula el crecimiento de una
o varias cepas de bacterias en
el coln

Inulina
 Probiticos y
prebiticos
Ayudan a colonizar el intestino modificando positivamente
la flora intestinal, mejorando elfuncionamientodel
sistema inmune mediante estimulacin de anticuerpo s

Impiden la actividad
de microorganismos
dainos
 Aumento de la actividad sacaroltica
del microflora intestinal

Efectos benficos atribuidos a los productos

finales de fermentacin del carbohidrato
( cidos grasos de cadena corta)

Reduccin de metabolitos potencialmente

txicosproducidos
en metabolismo de protenas en colon
umulacin de amonio en el colon y efectos para la salud hu

falla renal

Afecta al metabolismo
intermediario y la sntesis de
la DNA en clulas epiteliales
colnicas

Dieta normal de protena:

30% de nitrgeno presente en urea producida en hgado es salvada

por el colon

70% restante es utilizado para sntesis de aminocidos y protenas

protelisis urelisis

Proteasas,
peptidasas
 Disminucin de amoniaco en intestino
grueso
NH3

NH3

NH3

reduccin de
consumo de fermentacin de
protenas carbohidratos

del pH con la produccin de cidos grasos de

cadena corta

actividad de la proteasa disminuir

(pH 11-19)

metabolismo de aminocidos disminuye cuando los carbohidratos

fermentables estn presentes en el medio
 El uso de pre o probiticos incrementan la
actividad sacaroltica de la microflora
intestinal

El uso de istopos estables es una manera segura para

investigar procesos fisiolgicos in vivo

lactose[15N,15N] ureideutilizado como fuente de nitrgeno marcad

p-cresol
 lactosa-ureide
intacta

Enlace molecular entre la mitad del

carbohidrato y la urea resiste a la degradacin
enzimtica

degradada a [15N,15N] marcada-urea por bacterias

seleccionadas

La urea marcada
produccin 15NH3
hidrlisis rpida
mezcla con el
amonaco
presente en el
colon
 NH3
Causando un estimulo en el crecimiento bacteriano
por pre o probiticos se asume que ser ms
amonaco asimilado por las bacterias, con una
excrecin reducida en orina

p-cresol Se basa en el hecho de que es un metabolito

bacteriano nico que no es formado por las enzimas
Se absorbe humanas.

disminucin de la excrecin urinaria

refleja actividad proteoltica disminuida
en el colon

excreta por orina

 Introduccin

2. Objetivos
 Objetivo

Estudiar el efecto de tres pre-probiticos disponibles en el

mercado en el metabolismo de protena en colon en
voluntarios sanos

Lactobacillus casei Shirota

Bifidobacterium breve Yakult

Inulina rica en oligofructosa (OF-IN)

 Objetivos especficos

Evaluar los efectos a corto plazo y los efectos inducidos

a largo plazo

Efectos de largo plazo fueron evaluados despus de 4

semanas de intervencin y en la ausencia de substratos.

Adems, se investigo si los cambios en actividad metablica poda

ser correlacionado a los cambios cuantitativos en la poblacin fecal
total de Bifidobacterium.
 Introduccin

2. Antecedentes
 Ingredientes no digeribles de la dieta,
producen efectos beneficiosos estimulando
selectivamente el crecimiento y/o actividad
Prebitico de uno o ms tipos de bacterias en el colon.
s hidratos de carbono no digeribles
(oligosacridos y polisacridos), algunos
pptidos y protenas, y ciertos lpidos
(esteres y teres).
Estimulan las funciones protectoras del
sistema digestivo. Previenen infecciones
entricas y gastrointestinales. Efecto
Probioti protector de estos microorganismos se
cos realiza mediante 2 mecanismos: el
antagonismo que impide la multiplicacin
de los patgenos y la produccin de toxinas
que imposibilitan su accin patognica.

Beneficia al husped mediante el aumento

Efecto de la sobrevivencia e implantacin de los
Simbitic microorganismos vivos de los suplementos
o dietticos en el sistema gastrointestinal.
Efecto sinrgico entre ambos
 Microorganismos
en el clon

Bacteroides Bifidobacterias

Putrefaccin tirosin Fermentacin

a
p- pH
cresol
 Metabolismo del
nitrgeno en bacterias
Degradacin de ureido [15N, 15N]
lactosa
Degradacin de ureido [15N, 15N]
lactosa

UREIDO [15N,15N]
LACTOSA

Hidrolasa

ORIN
[15N,15N] UREA + LACTOSA
A

Ureasa

CO2 + 15
NH4
 Destino de 15N en el
organismo
UREIDO [15N,15N]
LACTOSA

Absorci Retenci
n n
N
15

15
N
15
N
15
N

Orina Orina
Urea Urea
[15
15N,15
15N] [15
15N,15
15N]

Materia Fecal

Pellet bacterianoMateria orgnica

Degradacin de lactosa
 Introduccin

3. Materiales y Mtodos
 Materiales y Mtodos
20
Sujetos voluntarios
sanos

21 1
1 ao 1
Sin 0 0
antecedentes:

Enfermedad
gastrointestina
l Sin antecedentes de
tratamiento antibitico o medico
Enfermedad durante al menos 3 meses
metablica previo al estudio
 Materiales y Mtodos
Diseo Experimental
Formacin aleatoria de dos grupos de tratamiento

BAS Basal
ST Periodo corto
LT Periodo largo
WO Lavado
Cada sujeto recibi dos diferentes sustratos dos veces al
da durante los periodos de ingestin
Tabla 1. Periodos de ingestin de los 2
diferentes grupos

Voluntario
s Biomarcador
Antes del estudio
Al inicio de cada
Comida Lactosa (15N,
periodo de
Final de cada
15
N) ureido
prueba
tratamiento y periodo
de lavado
 Al comienzo de cada perodo de El sustrato pre y/o
intervencin diettica probitico se administr
junto con la: Comida de
Dos veces al da se colectaban la prueba
orina y las heces para evaluar la
influencia real de los sustratos de
prebitico y/o probiticos en el colon

Sustratos pre y
probiticos
Sustrato prebitico Sustrato probitico
Oligofructosa enriquecida con
inulina
L. casei Shirota
(OF IN) 1:1
Mezcla de (2-1)

IN fructanos obtenidos de la
raz de achicoria
Bifidobacterium breve
liofilizado

Hidrlisis enzimtica
OF parcial de IN
 Producto idntico al
producto de leche, sin
L. casei Shirota
Placebo de sustrato
probitico
Maltodextrina

Comida de
prueba
8.4 g de protenas, 11,2 g de
grasa, y 26,7 g de hidratos
de carbono
Panca
ke +
75 mg de lactosa [15N, N]
15

ureido
 Recoleccin de muestras
Orin Hece
a s
Basal
Pancake

0-6 h
- 72 h
20
6-24 C
h
24- 5g
48h
 Procedimientos analticos
Determinacin de P-cresol en orina.

950 l.

pH1.
GC-MS
Desproteiniz.
50 l dimetilfenol.
Aceot (1mL). 0.5 l solucin.
Columna 30 m x 0.32 mm
(AT5-MS Alltech).
FM. Helio Grado CG.
Flujo 1.3 mL/min.
Corrida: 75C a 160C y a
280C.
m/z 59 a 590 a 2 barridos.
Muestra de Resultados se expresaron
en mg de p-cresol en orina.
orina
 Determinacin de nitrgeno total y 15N
en orina, heces y pellets de bacterias

Mdulo de
oxido-
Orina (15l) Contenido de nitrgeno
Heces (5-7 mg) reduccin total.
Pellet de bacateria (5- Oxidacin ( oxido de Porcentaje de dosis
7mg) cobre, oxgeno y oxido de administrada de 15
15N.

cromo a 1000C). Nitrgeno total.

Reduccin con N22 Excrecin de 15
15N en

usando cobre a 600C. fraccin bacteriana.

Estndar (sulfato de
amonio).
Espectrmetr
Muestras o de masas.

(De Preter y col., 2004)

 Separacin de pellet
bacteriano , fibra y fracciones
solubles en heces.

30 mL formilsalina (1%
formol/sln. Salina 0.9%
0.3% lauril sulfato de sodio
Filtracin en vacio con20m de
poro
Residuo se lav y filtro
nuevamente
500 mg de
muestra de
heces x 3
Filtrado
25000 g x 36 min.
Supernadante se descart
Sedimento ( pellet bacteriano).
Disolvi en 2 mL de agua libre de
pirgenos.
El pellet bacteriano fue secado y
pesado.
(Stephen y col.,
1979)
 Extraccin de ADN en heces

20000g x 5 min. Muestras Integridad de ADN se

Pellet en 1mL de TE buffer
checo en gel de
2000g x 5 min 250 L acetato de amonio
agarosa.
150 L sln. Enzimas ( 6 mg (7.5M).
lisosima, 40 L Extraccin 500 L Calidad y
mutanolisina) cloroformo. concentracin se
Incubacin a 37C x 40 min. Precipitacion de ADN C/ipa determin por
frio (0.5 vol.). espectrofotometra.
Heces (3x
Adicin de 500 L GES x
muestra.
1mL)
20000g x 5 min.
Lavado con MEOH 70%
ADN
260, 280 y 234 nm.

Disolver en 7.5 L de TE

(Vanhoutte y
col.,2004)
 Anlisis de PCR en tiempo
real
Primers 926f (5-AAA CTY AAA KGA ATT GAC
GG-3)
Primers 1392r (5ACG GGC GGT GTG TRC-
3).
94C por 3 min; (35 ciclos de 94C x 30s).
52C x 30s
72C x 1m.
72C x 5 min.
Purificacin del ADN
Anlisis de secuencia de ADN.
Comparacin de secuencia en base de
datos de GenBank. (Matsuki y
col.,2002)
 Introduccin

4. Resultados
Excrecin de 15 N en orina

Fig. 3. Effect of ST and LT Pre and/or Pro administration on urinary 15N excretion in
groups 1 and 2. Values are medians IQR. *P 0.05 compared with Bas.
 Excrecin de 15 N en orina

Fig. 2. Effect of ST and LT prebiotic (Pre) and/or probiotic (Pro) administration on total urinary
nitrogen (N) excretion in groups 1 and 2. Pla, placebo administration; Syn, synbiotic administration;
WO 13, WO periods 13. Values are medians interquartile ranges (IQR).
Excrecin urinaria de p-Cresol
 Cuantificacin del nivel de
Bifidobacteria en heces usando
tiempo real en PCR

Bifidobacterias fecales totales se

incrementaron significativamente despus
del consumo, a largo plazo de OF-IN.

En el grupo 2, la administracin a largo

plazo de la simbiosis da lugar a una
tendencia al aumento de los niveles de
Bifidobacterium.
Efecto de la administracin de pre y/o
probiticos en la excrecin total de 15N
Efecto de la administracin de pre y/o
probiticos en la excrecin total de 15N

Periodo corto OF-

IN
Total de 15N en
ambos grupos sin
diferencias
Efecto de la administracin de pre y/o
probiticos en la excrecin total de 15N

Periodo largo OF-

IN
y corto/largo de
combinacin
simbitica
Esta ltimas baja
15
N
significativamente

Lo que sugiere
que se retuvo
una mayor
fraccin de 15N
en el cuerpo
humano
Efecto de la administracin de pre y/o
probiticos en la excrecin total de
nitrgeno y de 15N en la masa bacterial
(pelet).
Efecto de la administracin de pre y/o
probiticos en la excrecin total de
nitrgeno y de 15N en la masa bacterial
(pelet).

Periodo corto OF-IN

Aumenta
significativamente 15N
en ambos grupos
Efecto de la administracin de pre y/o
probiticos en la excrecin total de
nitrgeno y de 15N en la masa bacterial
(pelet).

Periodo largo OF-IN o simbitico,

No se observa un efecto
significativo en el contenido de
15
N en el pelet bacterial en
ambos grupos
Efecto de la administracin de pre y/o
probiticos en la excrecin total de
nitrgeno y de 15N en la masa bacterial
(pelet).

Ni en el consumo de probiticos o el placebo resultaron en

un cambio significativo en el contenido de 15N en el pelet
bacterial en ambos grupos
 Introduccin

5. Anlisis de
Resultados y
 Grado de
fermentacin
proteoltica en
el clon

Grado de
excrecin
fecal y/o
urinaria

Marcadores de Amonia y
Sndrome urmico
cncer de clon p-cresol
 Reduccin
Reduccin dede
generacin
generacin yy
acumulacin
acumulacin dede
metabolitos
metabolitos
txicos
txicos

Disminuir
actividad
proteoltica de
microbiota

Incremento
Incremento dede la
la
actividad
actividad
sacaroltica
sacaroltica
 Con prebitico
Amonia y
Con administracin
p-cresol de probitico =
menor

Correlacin
entre excrecin
urinaria y fecal
de 15N

Retencin
Retencin

OF-INMicrobiota asociada
a la mucosa
 Excrecin fecal y
urinaria de 15N y
Efecto p-cresol despus
temporal del periodo de
lavado

Desaparicin al
cese de la
administracin
Estimulacin contnua
de microbiota
 Anlisis de Resultados
Efecto de Prebiticos vs Probiticos
Se demostr mayor efecto en el
metabolismo de amonio en el colon, por la
ingesta prebitica que en la probitica,
tanto a corto como largo plazo.

>
Anlisis de Resultados

Prebiticos Probiticos
Rpida fermentacin La administracin a
de CHOs que resulta corto plazo no
en un menor pH en influye en la flora
colon. bacteriana ni en la
actividad
metablica.
 Anlisis de Resultados
Efecto a corto plazo de OF-IN en la
excrecin de p-cresol y contenido de
15N

Se observ una modera correlacin.

 Anlisis de Resultados
Efecto de los probiticos
Mayor efecto de ambos microorganismos
en la excrecin de p-cresol que en el 15N.
N15

biomarcador
de actividad
microbiana

Los
Su efecto es
probiticos no
menor sobre
proveen
la excrecin
energa para
de 15N
la flora
 Anlisis de Resultados
Efecto de los probiticos
excrecin de p-cresol
Disminucin de la

Incremento en la utilizacin de
tirosina por parte de los probiticos

Reduccin de fermentacin
proteoltica debido a la inhibicin de
bacterias proteolticas.
 Diferencias microbiota
colnica
Sanos

Microbiota
colnica

Enfermedad
Inflamatoria
intestinal

Bacterias fermentacin proteoltica y sacaroltica en diferente composi

 Productos de la fermentacin sacaroltica
y proteoltica
Fermentacin sacaroltica (clostridium y
bacillus)
azucares, mucosa del colon
cido actico, propinico,
Y protenas,
butrico y lctico

Fermentacin proteolticas por las especies

(Bacteroides, Propionibacterium, Clostridium, Fusobacterium,
Streptococcus y Lactobacillus)

H2, CO2, CH4 ,

Hidrlisis Hidrlisis
cidos
Protenas orgnicos,
Pptidos sulfuros, amonio,
no digeridas
aminas,
compuestos
fenlicos.
 RUTA DEL P-CRESOL
Fermentaci
n
proteoltica

absorcin

Detoxificacin

Baja
mortalidad Bajo nivel
de p-cresol >
Sndrome
90
uremico
 CONCLUSIONES
El uso de biomarcadores p-cresol, lactosa(
15
N, 15N) ureido

OF-IN bifidobacterium L. casei shirota

breve

Efectos favorables sobre el metabolismo colonico de

protenas y amonio en voluntarios sanos.
En OF-IN el efecto se acompao por un incremento
en los niveles totales de bifidobacterias en heces.
RACIAS POR SU ATENCI