Introduccin a la Inmovilizacin de enzimas

FUNDAMENT
OS
MTODOS
APLICACIONE
S
 FUNDAMENTOS
DEFINICIN:
Confinamiento fsico de una enzima o clula en una
determinada regin del espacio, de manera que su
actividad cataltica se retenga, y pueda ser reutilizada
 INTRODUCCIN
La inmovilizacin de enzimas permite una mejora
significativa de su estabilidad, lo que hace posible su
empleo en la produccin industrial de productos
qumicos, farmacuticos, alimentos, en el tratamiento de
residuos, en el diagnstico y tratamiento de
enfermedades, y otras muchas aplicaciones.
Existen diferentes mtodos de inmovilizacin de
enzimas, y el efecto sobre las propiedades catalticas y
la estabilidad de los biocatalizadores obtenidos.
 CINTICA ENZIMTICA

Cintica enzimtica Cintica enzimtica con disminucin de actividad

especfica (Cataltica)
estndar
La inmovilizacin enzimtica permite una mejora significativa de
su estabilidad.
Sirve como medio de produccin industrial de qumicos,
farmacuticos, alimentos etc.
Ventajas frente a los catalizadores convencionales no biolgicos:
Presentan una gran actividad cataltica;
Muestran una gran especificidad de sustrato (incluso
estereoselectividad y regioespecificidad);
Son muy activos a temperatura ambiente y presin atmosfrica.
Por otra parte al ser solubles en agua, su separacin de los
sustratos y productos es difcil, y por tanto, no se pueden
reutilizar.
MTODOS DE INMOVILIZACIN
ENZIMTICA
MTODOS DE INMOVILIZACIN
ENZIMTICA
MTODOS DE INMOVILIZACIN DE ENZIMAS POR RETENCIN FSICA

Atrapamiento
Consiste en la retencin fsica de la enzima en las cavidades interiores de una matriz slida
porosa constituida generalmente por prepolmeros fotoentrecruzables o polmeros del tipo
poliacrilamida, colgeno, alginato, carraginato o resinas de poliuretano.
El proceso de inmovilizacin se lleva a cabo mediante la suspensin de la enzima en una
solucin del monmero, se inicia la polimerizacin por un cambio de temperatura o mediante
la adicin de un reactivo qumico.
El atrapamiento puede ser en geles o en fibras, que suelen ser ms resistentes que los geles.
En el primer caso, la enzima queda atrapada en el interior de un gel, mientras que en el
segundo caso la enzima se encuentra bloqueando una abertura dentro de las microcavidades
de una fibra sinttica.
El atrapamiento requiere poca cantidad de enzima para obtener derivados activos, la enzima
no sufre ninguna alteracin en su estructura y requiere un control riguroso de las condiciones
de polimerizacin, as como la comprobacin de que la naturaleza qumica del proceso no
altera los grupos reactivos de la protena.
MTODOS DE INMOVILIZACIN ENZIMTICA

MTODOS DE INMOVILIZACIN DE ENZIMAS POR RETENCIN FSICA

Por Adsorcin
El desarrollo de reactores o sistemas que contengan enzimas atrapadas ha
despertado gran inters en la industria. Estos reactores emplean membranas
permeables al producto final, permeables o no al sustrato inicial y obviamente
impermeables a la enzima. Mediante una bomba se establece un flujo lquido de
sustrato que atraviesa el reactor.
En general, en esta metodologa, se procede inicialmente a la adsorcin de la
enzima sobre la Inclusin en Membranas membrana que formar el reactor. Esta
adsorcin se puede realizar de dos formas:
1. Mediante el paso de una solucin tamponada de enzima a travs de la
membrana.
2. Por contacto continuo de una solucin de enzima con la membrana.
 MTODOS DE INMOVILIZACIN ENZIMTICA
MTODOS DE INMOVILIZACIN DE ENZIMAS POR
INMOVILIZACIN QUMICA
Unin Covalente
La unin covalente de una enzima a un soporte es quiz el mtodo
de inmovilizacin ms interesante desde el punto de vista industrial.
La metodologa de la unin covalente se basa en la activacin de
grupos qumicos del soporte para que reaccionen con nuclefilos de
las protenas. De entre los 20 aminocidos diferentes que se
encuentran en la estructura de las enzimas, los ms empleados para
la formacin de enlaces con el soporte son principalmente la lisina, la
cistena, la tirosina y la histidina, y en menor medida la metionina, el
triptfano, la arginina y el cido asprtico y glutmico. El resto de
aminocidos, debido a su carcter hidrfobo, no se encuentran
expuestos hacia el exterior de la superficie proteica, y no pueden
Mtodos de Inmovilizacin
enzimtica
Este mtodo presenta las siguientes ventajas:
1. La manipulacin de los derivados inmovilizados es sencilla.
2. La carga de enzima permanece constante despus de la inmovilizacin.
3. Los derivados pueden utilizarse en reactores en continuo, empaquetados, de lecho fluidizado o
tanque agitado.
4. Una mayor resistencia a la desactivacin por el efecto de la temperatura, de los disolventes
orgnicos o del pH, al tener estabilizada su estructura terciaria.
En cambio la inmovilizacin por enlace covalente tambin presenta una serie de inconvenientes:
1. Es necesario conocer la densidad de grupos activos por unidad de superficie, ya que condiciona
el nmero de uniones enzima-soporte y su geometra, que puede ser distorsionante y conducir a
derivados inactivos.
2. El proceso de inmovilizacin puede alterar la estructura del centro activo. Para evitar esta posible
alteracin, se realiza la inmovilizacin en presencia de un inhibidor que bloquee el centro activo.
3. La inmovilizacin covalente no es aconsejable en aquellas enzimas muy sensibles a cambios de
pH, fuerza inica, etc.
MTODOS DE INMOVILIZACIN ENZIMTICA
MTODOS DE INMOVILIZACIN DE ENZIMAS POR
INMOVILIZACIN QUMICA
Reticulado
Tambin denominado entrecruzamiento o cross-linking, es una tcnica que ha sido
ampliamente utilizada en la estabilizacin de muchas enzimas.
El mtodo del reticulado consiste en uso de reactivos bifuncionales que originan
uniones intermoleculares entre las molculas de enzima.

Como reactivos bifuncionales se pueden emplear dialdehdos, diiminosteres,

diisocianatos, sales de bisdiazonio e, incluso, diaminas si estn activadas con
carbodiimida, el resultado del reticulado son enzimas con enlaces intermoleculares
irreversibles capaces de resistir condiciones extremas de ph y temperatura.

El co-reticulado permite eliminar las prdidas de actividad enzimtica debidas a

efectos difusionales, mediante el entrecruzamiento de las enzimas con una protena
sin actividad enzimtica y rica en residuos de lisina (por ejemplo, la albmina bovina).
un procedimiento mixto de inmovilizacin muy comn consiste en inmovilizar la
enzima por adsorcin sobre una resina de intercambio inico o un soporte polimrico
MTODOS DE INMOVILIZACIN
ENZIMTICA
Actualmente el mtodo ms novedoso de cross-linking consiste en la
cristalizacin de enzimas y
su posterior reticulado con glutaraldehdo (cross-linked enzyme crystals o
clecs). el aumento de
estabilidad se basa en la obtencin de un entramado cristalino, donde las
molculas de enzima estn rodeadas exclusivamente por otras molculas de
protena. de esta manera la propia enzima acta como soporte, y su
estructura terciaria est estabilizada por las uniones covalentes
intermoleculares.

La estructura cristalina posee canales microscpicos (20-50 ) que permiten

el paso de sustratos hasta el centro activo de la enzima donde se cataliza la
reaccin. estos cristales pueden soportar temperaturas elevadas y ph
*Enantimero: Delgriego'', enntios, "opuesto", y '', mros, "parte" o "porcin"), tambin
extremos, as como
llamadosismeros pticos,la son
accin dedeestereoismerostales
una clase las proteasas. Esta quetecnologa
en la pareja dese ha
compuestos la molcula
aplicado a enzimas,
de uno es imagen especularlas cuales
de la molculasedelhan
otro yutilizado en la obtencin de
no son superponibles
compuestos enatiomricamente puros y en la sntesis de pptidos.
VENTAJAS DEL EMPLEO DE ENZIMAS
INMOVILIZADAS

1. El aumento de la estabilidad de la enzima;

2. La posible reutilizacin del derivado, por lo que disminuyen los costes del proceso.
3. La posibilidad de disear un reactor enzimtico de fcil manejo y control, adaptado a
la aplicacin de la enzima inmovilizada.
PRINCIPALES INCONVENIENTES DEL PROCESO DE INMOVILIZACIN

1. La alteracin de la conformacin de la enzima respecto

de su estado nativo.
2. Pueden existir distintas fracciones de protenas
inmovilizadas con un diferente nmero de uniones al
soporte.
3. Siempre suele haber una prdida de actividad de la
enzima durante la movilizacin.
4. El biocatalizador es ms caro que la enzima nativa
APLICACIONES EN BOSENSORES
En bosensores:

Los bosensores son de gran utilidad en el campo del diagnstico

clnico. Los niveles sricos de glucosa, lactato y cido rico se
pueden detectar mediante electrodos enzimticos disponibles
comercialmente. Actualmente, el desarrollo de nuevos
bosensores va dirigido a la deteccin de frmacos, clulas y virus
patgenos.
En el caso del control de calidad en las industrias alimentarias, los
bosensores pueden determinar el grado de contaminacin
microbiana, o por ejemplo, cuantificar el azcar presente en
bebidas.

Medidor de grados
Medidor de Alcohol (% o Gay-Lussac Brix
*Los Bx
grados brix cuantifican la cantidad de
solidos (Azcares) que estn disueltos en un
GL) lquido
 APLICACIONES EN BOSENSORES
Finalmente, los bosensores pueden ser muy tiles en el control de la polucin del
medioambiente. Los analizadores de contaminantes en el agua se basan en el empleo de
bosensores capaces de detectar la presencia de residuos txicos, pesticidas, herbicidas
o microorganismos.
 APLICACIONES MDICAS
Existen muchas enfermedades causadas por una alteracin o
carencia de una determinada enzima. Tambin hay enzimas con
actividad antitumoral, cicatrizante y con otras acciones
teraputicas. El tratamiento con estas enzimas inmovilizadas
permitira una accin ms prolongada, ya que seran ms
resistente a la accin de las proteasas. Por ejemplo, la L-
asparaginasa se utiliza en el tratamiento de leucemias y cnceres
diseminados que requieren asparragina para desarrollarse. En la
actualidad se ha diseado un hemodializador de fibra hueca que
contiene asparaginasa inmovilizada

L-
 APLICACIONES EN LA INDUSTRIA
FARMACUTICA
La Industria Farmacutica trabaja con molculas lbiles, y en muchos casos
con molculas quirales*. El empleo de enzimas inmovilizadas es una
alternativa seria a la sntesis qumica en pasos clave, donde no conviene
trabajar a temperaturas altas o se requiere una elevada especificidad de
sustrato. Los enzimas son unos reactivos quirales estrictos, es decir,
biocatalizadores con una estructura tridimensional asimtrica definida que
permiten la obtencin de productos de gran pureza ptica. Se trata de una
ventaja fundamental cuando las reglamentaciones exigen la sntesis de
compuestos pticamente puros, ya sean frmacos, hormonas o antibiticos.
*Quiralidad:
Quiralidad Molecular:

La palabra quiral fue introducida por William Thomson (Lord Kelvin) en 1894 para designar objetos que no son superponibles
con su imagen especular. Aplicado a la qumica orgnica, podemos decir que una molcula es quiral cuando ella y su imagen
en un espejo no son superponibles.

La quiralidad est a menudo asociada a la presencia de carbonos asimtricos. Un carbono asimtrico es aquel que se une a
cuatro sustituyentes diferentes.