BIOSNTESIS DE POLIHIDROXYALCANOHATOS

(PHA) POR Ralstonia eutropha CEPA

Re2058/pCB113 A PARTIR DE ACEITE DE VEGETAL.

Roberth Cardenas Chiquillo y Hussey Quevedo Mojica

Biotecnologia
2017
 INTRODUCCION

Los polihidroxialcanoatos (PHA) son

PHA polisteres biosintetizados por

microbios, que se almacenan en forma
de grnulos intracelulares, para
almacenamiento de energa y de
carbono.
 Rasltonia
eutropha
Re2058/pCB11
3

Filo: proteobacteria
Clase: Beta-
proteobacteria
MODIFICACIONES GENTICAS
R. Eutropha H16
 R. Eutropha
Re2058/pCB113
SABIAS QUE?

La produccin de plstico a
nivel mundial aument de
204 Mt en 2002 a 299 Mt en
2013. Desde 2011 la
produccin anual est
aumentando alrededor del
4% (Plastic Europe 2015).
Hoy en da, la mayor parte
de la produccin de plstico
industrial depende del
petrleo a base de fsiles.
Para reducir esta
dependencia, se deben
desarrollar nuevos procesos
de produccin de polmeros
basados en sustratos
alternativos.
CONDICIONES BITICAS Y ABIOTICAS
DEL CULTIVO

Condiciones biticas: La fermentacin para produccin de

PHA no necesita de consorcios microbianos, ya que esta
fermentacin se realiza de manera invitro, a la cepa a
utilizar se le facilitan las condiciones para la fermentacin.
FORMULACIN DEL MEDIO PARA EL
BIOPROCESO

La cepa mutante de R. eutropha se cultivara aerbicamente en

caldo tripticasa de soya (TSB medio mnimo) libre de dextrosa
que contendr:

4,0 g/litro de NaH2PO4

4,6 g/litro Na2HPO4
0,45 g/litro K2SO4
0,39 g/litro MgSO4
62 mg/litro CaCl2
1 ml por litro de una solucin de elementos traza. La solucin de
elementos traza consista en 15 g/litro FeSO 4 7H2O, 2.4 g/litro
MnSO4 H2O, 2.4 g/litro ZnSO4 7H2O, y 0.48 g/litro CuSO4 5H2O
disuelto en cido clorhdrico 0,1 M.
A su vez el medio contendr sulfato de gentamicia a una
concentracin de 10g/ml como agente selectivo e inhibidor
de microbiota contaminante.

Para la fermentacin el medio mnimo ser suplementado con

20 g/L de aceite de palma y 4 g/L de NH 4Cl equivalente a 75
mM de nitrgeno, el aceite de palma ser alimentado entre 24
48 hrs con un paso aproximado de 5 g/L. A su vez la baja
concentracin de nitrgeno una vez sea agotada induce a la
acumulacin de la fuente de carbono y produccin de PHA
MACRO Y MICRO - NUTRIENTES
Macronutrientes: aceite de palma como fuente de carbono y
NH4Cl como fuente de nitrgeno.
Micronutrientes: NaH2PO4, Na2HPO4, K2SO4, MgSO4, CaCl2,
FeSO4 7H2O, MnSO4 H2O, ZnSO4 7H2O, y CuSO4 5H2O
 MEDIO MODIFICADO?

Este medio es un medio modificado ya que la utilizacin de aceite de

palma para ser usado como nica fuente de carbono, lo que hace,
que no posea una formula comercial, sumado a esto la incorporacin
de las diferentes sales (macro y micronutrientes), hace la difcil
formulacin del medio, por ello es necesario la preparacin por
componentes, asemejando la proporcin biolgica de componentes
presentes en R. eutropha, para llevar acabo el bioproceso.
MTODO DE FERMENTACIN

El sistema de fermentacin es de tipo

fed batch (proceso de fermentacin
alimentada) ya que el que es un
proceso cerrado discontinuo pero
alimentado, con una entrada de
aceite de palma entre 24 y 48 horas
con un paso aproximado de 5 g/L con
intervalo de 2 horas hasta alcanzar
concentracin total de
aproximadamente 170 g/L, basado en
el volumen inicial, es decir el sustrato
se aade escalonadamente a medida
que progresa la fermentacin.

Para el control inicial del pH y la alimentacin de

nitrgeno, se proporcion al cultivo, un volumen
calculado de una solucin madre de NH4OH al 14%
(p / v) para alcanzar una concentracin de
nitrgeno total de 480 mM de nitrgeno, basado en
el volumen inicial.
 TIPO DE FERMENTACIN

Segn la clasificacin de acuerdo con la dependencia de la

formacin del producto respecto del metabolismo energtico, la
fermentacin pertenece al tipo II, debido a que el producto deriva
tambin del sustrato utilizado para el metabolismo primario, pero la
produccin tiene lugar en una va secundaria que est separada del
metabolismo primario.

La va biosinttica de PHB apartir de

azucares consiste en tres reacciones
enzimticas catalizadas por tres
enzimas diferentes, pero es
importante aclarar que en principio
se parte de lagluclisiscomo ruta
primaria del metabolismo.
 VAS DE BIOSNTESIS DE
PHAS
Va I
Va Va
II III

-cetoaciloCoA tiolasa

cetoacetil-CoA reductasa
enoil-CoA hidratasa
3-hidroxiacil-acil-CoA tra

3 hidroxibutiril-CoA se polimeriza
SE PRESENTA EL FENOMENO DE
DIAUXIA?

Para la produccin de PHA por R. eutropha no se presenta el

fenmeno de diauxia, ya que solo se presenta un nica fuente de
carbono en el medio de fermentacin, por lo cual se puede
evidenciar una curva de crecimiento celular tpica.
El fenmeno de diauxa es atribuido a la utilizacin secuencial de
distintas fuentes de carbono, en donde primero se utiliza un
sustrato y despus se metaboliza el otro.
 OBTENCIN DEL METABOLITO
ASOCIADO A LA CURVA DE
CRECIMIENTO

TROFOFAS IDEOFASE
E
LOG CLULAS

CELULAS

METABOLIT
O

SUSTRATO

TIEMPO Hrs
 DOWNSTREANG PROCESSING

Cmo se extrae y se recupera?

DISOLVENTE NO
HALOGENADO HALOGENADO

CLOROFORM METANOL
O

PRODUCTO
 EXTRACCIN DE BIOMASA
BACTERIANA
MTODO CONVENCIONAL
-La insolubilidad de PHA en
metanol y la solubilidad en
cloroformo.
-Despus de la cosecha, los
lpidos y otros componentes
lipfilos de las clulas
bacterianas se eliminan por
reflujo en metanol caliente
seguido por solubilizacin de
PHA en cloroformo caliente.
-Aunque este mtodo
proporciona PHA de alta pureza,
sin embargo, una enorme
cantidad de solvente peligroso.
MTODO
-Destinado a evitar el uso de
disolventes orgnicos
-Las clulas bacterianas se
tratan con una mezcla de
enzimas (incluyendo lisozimas,
proteasas y nucleasas) y
detergentes para eliminar
paredes celulares, protenas y
cidos nucleicos dejando atrs
PHA intacta.

BIOMASA
 1 OBTENCIN Y CONSERVACIN DE LAS
MUESTRAS A PARTIR DEL FERMENTADOR

FERMENTADOR
El sedimento de
clulas lavadas se
resuspendi
despus en 2 ml
de agua fra, se
congel a -80C,
Alcuotas de 3- se liofiliz y
14 ml despus se
determin la
5 ml de agua fra CDW.
y 2 ml de hexano
Centrifugacin 10- fro para eliminar
15 min a 6.500 el aceite residual.
rpm, 1 mL del
sobrenadante a
-20C.
DETERMINACIN DEL PESO SECO DE
LAS CLULAS

de 3- 3-
hidroxibutirato de hidroxihexanoato
metilo de metilo
El peso seco de clulas residuales (RCDW) se defini como CDW menos la masa
del PHA.

DETERMINACIN DEL PESO MOLECULAR DEL PHA.

Para las determinaciones de peso molecular de (PHB-co-HHx), el polmero
se extrajo de clulas liofilizadas con cloroformo.
Masas iguales de clulas liofilizadas se pesaron para formar una solucin
de PHA de 3 mg / ml con un volumen total de 2 ml.
P.M:
Cromatografa
Extraccin de de
PHA permeacin
POLITETRAFLUOROETI en gel (GPC).
LENO
 CARACTERIZACIN Y
PURIFICACIN DE PHA
120 Horas de crecimiento
Se aadieron 100 ml
PHA se aisl a partir de clulas de MIBK a 1,5 g de
liofilizadas por extraccin del clulas secas y se
polmero con Metil Isobutil agit a 100 C
Cetona (MIBK). Para cada durante 4 h bajo
extraccin. condiciones de
reflujo.
MUESTRA

PHA se precipit de la solucin

por la adicin de 3 volmenes
de hexano
 GENES IMPLICADOS

Los genes que codifican las protenas implicadas en la biosntesis de

PHA se designan en orden alfabtico como phaA (cetoilasa), phaB
(acetoacetil-CoA reductasa), phaC (PHA sintasa), phaG (protena
portadora de 3-hidroxiacil-acil-CoA transacilasa) PhaJ (enoil-CoA
hidratasa) y as sucesivamente.

Los genes requeridos para la degradacin de PHA se designan en

orden alfabtico inverso tal como phaZ para las despolimerasas PHA,
phaY, phaX, phaW, etc.
 VISTA GENERAL DEL METABOLISMO DEL
POLIHIDROXIBUTIRATO (PHB) EN R. EUTROPHA.
 COSTOS $$$

La economa del bioproceso, se basa en la utilizacin

de fuentes orgnicas de carbono (grasas animales,
aceites vegetales y jugos derivados de verduras y
frutas) como materia prima en la produccin de
PHAS, a su vez la limitacin de nitrgeno disminuye
los costos de produccin.

Los PHAS son sintetizados intracelularmente y

para su obtencin requieren procesos de
extraccin y purificacin que se fundamentan
en la utilizacin de solventes orgnicos e
inorgnicos que aumentan los costos de
produccin.
 IMPLICACIN SOCIAL

El impacto social que trae consigo la produccin de

PHAS por R. eutropha a partir de aceite de palma,
principalmente es la reduccin de la contaminacin
causada por utilizacin de plsticos derivados del
petrleo, a su vez al ser los PHAS bioplasticos
tienen un menor tiempo de degradacin pudiendo
reducir la acumulacin de los residuos generados
por el hombre. Tambin este bioproceso refleja una
cultura ambiental, la cual hoy en da ha sido
adoptada de manera positiva y muy rpidamente,
lo cual motiva a nuevas empresas a apostarle a la
Tambin se evita laproduccin
contaminacin que
de estos se
bioplasticos.
produce por la superproduccin de plsticos
derivados del petrleo, los cuales contaminan el
planeta de manera creciente y sus consecuencias
segn muchos cientficos y ecologistas serian
devastadoras.
 CONCLUSIONES

Son muy variadas las vas para la biosntesis de cidos

grasos en donde a partir de los diferentes sustratos se puede
lograr la produccin de polihidroxialcanoatos, lo que ampla
la posibilidad de utilizar una gran gama de sustratos
permitiendo que el proceso sea mucho ms interesantes
pues se puede partir del uso de carbohidratos obtenidos a
partir de remolacha y otros restos vegetales, como tambin
de alcoholes, aceites vegetales y cidos orgnicos, los cuales
dentro de su composicin poseen cidos grasos de tipo
saturado e insaturado que brindan la posibilidad de
metabolizarlos para la produccin del compuesto de inters.
 La posibilidad de poder implementar dentro de un
proceso de fermentacin diferentes substratos, amplia
del mismo modo las diferentes vas de biosntesis para
la obtencin de polihidroxialcanoato, lo que permite no
sesgar el mecanismo de accin hacia una sola ruta
metablica, sino que permite de cierto modo ampliar la
informacin y el conocimiento de las diferentes vas
biosntesis en donde la produccin tambin se
considera exitosa.
 La modificacin gentica como herramienta
indispensable para la transformacin celular y la
adquisicin de nuevas caractersticas, permite el
mejoramiento gentico lo que se expande hacia una
gran variedad de manipulaciones genticas que
pueden efectuarse para promover la produccin de
los PHA y de otros compuestos de inters.

El beneficio ambiental producto de la produccin de

polihidroxialcanoato a partir de Ralstonia eutropha,
permite dar solucin a una de los principales
problemas asociados al uso de polmeros debido a
que por su carcter recalcitrante actualmente se
considera un problema ecolgico, es as como
gracias a la biotecnologa ha permitido la
produccin de polmeros novedosos que poseen
propiedades fsicas predeterminadas, los cuales se
consideran candidatos excelente para la sustitucin
de los polmeros sintticos.
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