UNIVERSIDAD ALAS PERUANAS

(Diagnostico viral, aislamiento viral, Sistemas biologicos,

Identificacion Viral,ECP )
 C O
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S CO
O
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G
A OL O
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D IR D ES

V
G
EN
ER AL
I DA
Gran parte de las tcnicas utilizadas en el diagnstico clnico se basan
en pruebas serolgicas que identifican anticuerpos especficos frente a
diversas protenas antignicas. Sin embargo, existen circunstancias en
las cuales son necesarias pruebas que detecten precozmente la
infeccin viral (tratamientos especficos, medidas profilcticas, etc.).

En algunas infecciones virales es posible detectar la presencia de

antgenos virales previamente al desarrollo de la seroconversin,
siendo esta prueba la nica evidencia de la exposicin al virus cuando
no existe aumento de los niveles de anticuerpos circulantes (pacientes
inmunodeprimidos).

Igualmente la deteccin del genoma viral puede favorecer la

precocidad del diagnstico viral y su confirmacin. En la ltima dcada
se han desarrollado una serie de tcnicas para el diagnstico viral
basadas en la deteccin de cidos nucleicos. De ellas la Reaccin en
cadena de la polimerasa (PCR) es la ms utilizada
DIAGNSTICO DE LAS INFECCIONES VIRALES

Directo:
Demostracin de la presencia del virus en la muestra clnica
Indirecto:
Demostracin de la presencia de anticuerpos especficos en el suero
DIAGNOSTICO DIRECTO DE LAS INFECCIONES
VIRALES
Inoculacin en animales de experimentacin
Inoculacin en huevo embrionado
Inoculacin en cultivos celulares:
primarios, diploides, lneas contnuas
Deteccin del virus en la muestra:
visualizacin partcula viral (M/E)
deteccin de componente estructural
(Ag, ac. nucleico)

Demostracin de la presencia del virus en la muestra clnica

METODOS DIRECTOS

Son aquellos que detectan:

1.El virus como agente infeccioso (aislamiento viral).

2. La presencia de antgenos virales (tcnicas

inmunolgicas): Inmunofluorescencia (IF),
Enzimoinmunoanlisis (EIA), Test de Aglutinacin.

3.La presencia de cidos nucleicos virales (PCR, etc.).

4.El virus como partcula viral (microscopa electrnica).

DIAGNOSTICO INDIRECTO DE LAS
INFECCIONES VIRALES
Infecciones agudas:
IgM, seroconversin, serorefuerzo
Infecciones crnicas:
IgG, avidez

Demostracin de la presencia de anticuerpos especficos en el

suero
Son aquellos que reconocen la respuesta inmune (humoral o celular)
por parte del husped: . Deteccin de anticuerpos especficos
antivirales por tcnicas inmunolgicas (EIA, IFI, WB, etc.). Produccin
de anticuerpos in vitro.

En el curso de una infeccin varan las poblaciones de anticuerpos

frente al agente infectante. En una primera fase la clase predominante
suele ser IgM, mientras que con el transcurso del tiempo las IgM
disminuyen hasta desaparecer o quedar a baja concentracin residual
y, en cambio, aumentan las IgG. La bsqueda de anticuerpos clase IgM
es de utilidad para hacer diagnstico de infeccin reciente en una sola
muestra de suero extrada en el perodo agudo de la enfermedad. Este
mtodo se emplea para el diagnstico de enfermedades como:
Rubola, Citomegalovirus, Hepatitis a virus A, etc.

La bsqueda de anticuerpos clase IgG en una sola muestra se utiliza

como tcnica de tamizaje, por ejemplo, para el diagnstico de la
infeccin por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH).
Posteriormente los hallazgos positivos son confirmados en la misma
muestra de suero por otra metodologa.
La seroconversin es el aumento del ttulo de anticuerpos cuatro
veces o ms observado en dos muestras pareadas de suero. La
primera muestra se obtendr en el perodo agudo de la enfermedad
y la segunda, 15 a 21 das despus de la primera, en el perodo de
convalesencia.

La seroconversin es til para establecer el diagnstico retrospectivo,

pero no para el diagnstico temprano de una infeccin, puesto que
debemos esperar al perodo de convalecencia para obtener la
segunda muestra del suero.

Este tipo de diagnstico es til para estudios epidemiolgicos.

Las diferencias de ttulos deben ser mayores de cuatro veces para

tener valor estadstico y se debera estudiar ambas muestras
simultneamente.
Las determinaciones serolgicas tambin nos pueden
informar sobre el estado inmune del paciente frente a
muchas infecciones virales, como paperas, sarampin y
rubola, donde la presencia de anticuerpos especficos indica
que el individuo ha estado expuesto previamente al virus y
que es inmune para una nueva infeccin.
A veces el diagnstico serolgico tiene dificultades, por
ejemplo: cuando se realiza en recin nacidos para identificar
la causa de una infeccin congnita. La evaluacin de los
resultados en este caso es difcil porque los ensayos
serolgicos detectan ante todo IgG, y mucha de la IgG
presente en el suero del nio provino de la madre por va
transplacentaria y no es posible diferenciar la IgG del nio de
la IgG de la madre.
Tradicionalmente, el diagnstico de las enfermedades virales
congnitas se realiza mediante determinaciones seriadas de
IgG en el suero. El descenso del titulo de anticuerpos indica
que los anticuerpos eran maternos y que el nio no est
infectado. El aumento en el ttulo de anticuerpos indica que
el nio esta produciendo anticuerpos y por lo tanto esta
infectado. Sin embargo, hoy en da el diagnstico serolgico
viral se ha simplificado con las nuevas tcnicas que detectan
TOMA DE MUESTRA
El buen diagnstico empieza
con una buena muestra.

La definicin del momento y forma de recoleccin, transporte y

conservacin de la muestra son esenciales para el resultado del
estudio. La recoleccin de la muestra debe considerar inicialmente dos
factores: el sitio u rgano lesionado y el virus presuntamente
responsable. Las muestras ms comnmente usadas son las
secreciones respiratorias, deposiciones, sangre y lquido
cfaloraqudeo. Para aislamiento viral
CONSIDERACIONES A LA TOMA DE MUESTRAS
PARA EL DIAGNOSTICO DE LA INFECCION
VIRAL
Precoz
Adecuada (raspados, lavados ..) clulas!
Localizacin primaria de la infeccin y otras posibles
Transporte y conservacin
Descontaminacin
Infeccin enfermedad (viremia)
 NORMAS GENERALES PARA TOMA Y ENVIO DE
MUESTRAS PARA ESTUDIO VIROLOGICO

PERIODO OPTIMO DE RECOLECCION:

Deteccin viral:

Cantidad de virus excretado , generalmente alcanza su nivel

mximo por un corto perodo despus de aparecidos los
sntomas clnicos y luego declina rpidamente.
Tomar la muestra en la fase aguda de la enfermedad: primeros
das y no ms all de 1 semana. Ej: Influenza, dengue, rotavirus
SITIO DE OBTENCION:
Depende de la patogenia del virus.
RECOLECCION DE LAS MUESTRAS
Envases:

Estriles y no tener trazas de ningn desinfectante o detergente.

De tamao adecuado y llenado slo hasta la mitad.

Cierre hermtico con tapa rosca o tapn de goma y rodearse con una cinta
adhesiva que impida que el tapn se suelte. No usar tapn de algodn que,
adems de filtrarse, contamina la muestra.

Algunas muestras para aislamiento viral deben colocarse en el medio de

transporte que el laboratorio indique o proporcione especialmente para tal efecto
OBTENCIN DE LA MUESTRA
AISLAMIENTO VIRAL
MUESTRA (MEDIOS
Buffer de fosfatos (PBS) DE
+ 2% SFB + ATB+AM
MEM + 2% SFB+ ATB+AM
TRANSPORTE)
PBS + TPB + 0,5% gelatina + ATB + AM.
PBS + Glicerina 50% + ATB + AM
Leche descremada estril + ATB + AM

ATB: Gentamicina 20 g/ml, Penicilina 1000-2000 UI /ml,

Estreptomicina: 0,2-2 mg/ml,
AM : Nistatina 100-150 U/ml / Fungizone 2,5 g/ ml
MEM : Medio de Cultivo Celular sin Suero
PBS: SOLUCION SALINA TAMPONADA, solo til para colectar Virus Influenza
 AISLAMIENTO VIRAL
Lavado (PBS, MEM con ATB)
MUESTRA (PROCESAMIENTO)
Corte y macerado con arena estril
TEJIDOS
Diluyente (10% , MEM con ATB)
Centrifugacin (3000 rpm 15 min.)
Centrifugacin (6000 rpm 15 min.)
Obtencin del sobrenadante
Filtracin (optativo)
Fraccionar- Conservar -70C
Inoculacin (puro y en diluciones)
AISLAMIENTO VIRAL
MUESTRA (PROCESAMIENTO)
HISOPOS
Compresin (en el lquido de transporte)
Centrifugacin (3000 rpm 15 min.)
Centrifugacin (6000 rpm 15 min.)
Obtencin del sobrenadante
Filtracin (optativo)
Fraccionar- Conservar -70C
Inoculacin (puro y en diluciones)
 SANGRE
Extraccin con anticoagulante
Procesamiento inmediato
Centrifugacin en gradiente
(1500 rpm 15 min.)
Extraccin de fraccin de g. blancos
Lavados sucesivos (PBS, SF)
Inoculacin
HECES
Dilucin 10% (MEM con ATB)
Agitar con perlas de vidrio
Doble Centrifugacin
(3000 rpm 15 min., 10000 rpm 30 min.)
Descarte de capa de lpidos
Tratamiento con cloroformo
Decontaminacin con ATB 1 h. 4C
Filtracin del sobrenadante (optativo)
Fraccionar- Conservar -70C
Inoculacin (diluciones)
 EXUDADO FARINGEO

Toma:
Se pide al paciente que se siente y coloque su cabeza hacia atrs. Se
ilumina bien la cavidad orofarngea y con un bajalenguas se empuja
la lengua hacia abajo para facilitar el acceso a la parte posterior de la
faringe. Con un hisopo de algodn se hace un raspado de las reas
hipermicas, purulentas o necrticas.

Envo:
Agentes virales: El hisopo con la muestra se introduce en un tubo de
tapn de rosca con 1 a 2 mL de solucin salina isotnica estril. Se
rompe la varilla de madera a la altura del tapn y se tapa
hermticamente.
EXUDADO NASOFARINGEO
Toma:
Se pide al paciente que se siente y coloque su cabeza hacia atrs. Se
introduce un hisopo de alginato de calcio, dacrn o nylon por las fosas
nasales hasta la nasofaringe, sin tocar los cornetes y tratando de
producir un acceso de tos. El hisopo se mantiene in situ de 10-15
segundos durante el acceso de tos, despus de lo cual se retira
rpidamente.

Envo: Si la muestra no se va a procesar de inmediato, el hisopo se

mantiene en un medio de transporte y se enva de inmediato con
refrigerante:
Agentes virales: El hisopo con la muestra se introduce en un tubo de
tapn de rosca con 0.5 mL de solucin salina isotnica estril. Se rompe
la varilla de madera a la altura del tapn y se tapa hermticamente.
HISOPO RECTAL

Toma:
La muestra se toma introduciendo la punta de un hisopo de
algodn humedecido en solucin salina o medio de transporte
en el recto y hacindolo rotar ligeramente. Estar bien tomada
si observamos un ligero color caf en el hisopo. En caso de ser
para estudios virales mandarlo en refrigeracin, aunque no se
recomienda usar hispo para el caso de virus.

Envo:
Refrigerar el paquete, para el caso de estudios virales.
LIQUIDO CEFALORRAQUIDEO (LCR)

Toma:
La obtencin de la muestra es responsabilidad exclusiva del
mdico quien la tomar bajo rigurosas condiciones de asepsia.
Se deben recuperar unos 5 mL los cuales se conservan en
tubos de vidrio estriles con tapn de rosca.

Envo:
Cuando se trate de estudios virolgicos, la muestra se enva
refrigerada. Si se sospecha de una infeccin bacteriana, la
muestra no debe refrigerarse, ni acompaarse de hielo. Cuando
el envo tarda ms de 24 horas, la muestra debe enviarse
inoculada en medios especficos.
MATERIA FECAL

Toma:
Las muestras fecales pueden ser obtenidas en recipientes limpios de boca
ancha y con tapa hermtica que permitan su fcil transporte, de preferencia
que no sean de vidrio. Las heces obtenidas del suelo, excusado as como
del paal no son satisfactorias, debido a que pueden contaminarse con
material extrao.

Envo:
Estudios virales: el tiempo de envo debe ser menor a los tres das y en
condiciones de refrigeracin, con la cantidad de 10 gramos.
ORINA

Toma:
Se usa un recipiente estril, de boca ancha con tapa de rosca. Aunque el
sondeo vesical es la forma ideal para evitar la contaminacin, debido a la
posibilidad de extender la infeccin en el paciente, se utiliza en casos muy
excepcionales en el hospital. Por esto, la miccin espontnea es la tcnica
ms aconsejable: despus de una cuidadosa limpieza de la regin
urogenital con agua y jabn ,se instruye al paciente para que deseche la
primera parte de la miccin y se colecta el chorro medio.

Envo:
ESTUDIOS VIRALES /10-15ML / PRIMERA ORINA DE LA MANANA, ENVIAR
CON HIELO Y TRANSPORTAR AL LABORATORIO INMEDIATAMENTE

EL ENVO DEBE TARDAR

MENOS DE UN DA
RASPADO DE LESIONES Y/O
COSTRAS
Toma:
Se lava bien el sitio de la lesin, primero con agua y jabn y luego con
alcohol al 70%, utilizando gasa (no debe utilizarse algodn) y se deja secar.
Con bistur estril, se raspa el borde de la lesin y se recoje el material que
se desprende. Si la epidermis est desprendida se toman porciones de
sta. Para la bsqueda morfolgica del agente, las costras o escamas se
colocan en una caja de petri estril y se asegurar la tapa con cinta adhesiva
para que no se abra, o bien se pueden colocar en sobres de papel que se
sellan.

Envo:
El material slo debe congelarse cuando la muestra es para estudios
virolgicos.
TRANSPORTE DE LAS
MUESTRAS
Condiciones ambientales:

La temperatura influye en la viabilidad de los virus durante el

transporte.

Mantenerse a 4 C en forma permanente desde el momento

de la obtencin.

La sangre no se debe congelar

Para su envo, debern rodearse de unidades refrigerantes y

transportarse inmediatamente al laboratorio en cajas trmicas.

Rotulacin adecuada (nombre del paciente y el tipo de muestra, fecha toma )

MEDIOS DE TRANSPORTE
MEDIOS DE TRANSPORTE
IMPORTANCIA DEL DIAGNSTICO
VIROLGICO
CON FINES DIAGNSTICOS ESPECFICOS :
Adecuar la teraputica: en caso de encefalitis herptica, Fiebre
hemorrgica argentina, CMV, rabia, HIV y herpes.
Efectuar pronstico: en caso de rubola, enfermedades congnitas.
CON FINES EPIDEMIOLGICOS :
Campaas de salud. Endemias. Incidencia de virosis en el pas.
Evaluar campaas de vacunacin (profilaxis).
CONSERVACIN DE LA MUESTRA

Temperatura adecuada :
A 4 a 8 C se puede conservar la muestra por 1 a 2 das.
A menos 70C puede perder infectividad al descongelarse. La
muestra perdurar meses a aos.
A menos 20C puede perderse ms rpido la infectividad. La muestra
perdurar semanas a meses.
En caso de distancias cortas: hielo.
En caso de distancias largas: hielo seco.
Lo ideal: cold packs termos de telgopor con hielo seco.
El medio de transporte utilizado es el comercial de HANKS ( con caldo
al 2%) que tiene antifngicos, antibiticos (vancomicina y
gentamicina).
 S
C O
I
G
LO
I O
B
AS
E M
S T
SI
Uno de los sistemas biolgicos mas empleados en el aislamiento del
virus dengue, a pesar de su baja sensibilidad, ha sido el ratn
lactante inoculado por va intracerebral. Tambin se han utilizado
diferentes sistemas celulares de mamferos entre los que se
encuentran las lneas celulares: BSC-1, VERO, BHK-21, LLCMK2.
En las ltimas dcadas se han desarrollado una serie de lneas de
mosquitos que han resultado ser mucho ms sensibles a la
infeccin por el
virus que con los sistemas anteriores. Dentro de las ms utilizadas
se encuentran las clulas AP- 61, C6\36, TRA-284 y C6\36 HT. La
elevada sensibilidad de estos sistemas, ha permitido alcanzar un
alto ndice de aislamiento. Actualmente se emplea con xito la
inoculacin intratorcica de mosquitos. Este mtodo ha
demostrado ser el ms sensible.
SISTEMAS BIOLOGICOS
RATON LACTANTE.
RATONES,RATAS, CUYES,CONEJOS.
HUEVOS EMBRIONADOS.
LINEAS CELULARES.
INSECTOS, etc.
 A L
IR
V
E ON
D I
S AC
BA C
E F I
U T I
PR E N
ID
IDENTIFICACION VIRAL
Pruebas fsico-qumicas
ECP en cultivos celulares
Tcnicas serolgicas con Ac especficos (IHA, VN, ELISA)
Deteccin de Ag con Ac especficos (IF, ICQ).
Deteccin de AN (PCR, Sondas )
M Electrnica
 Aislamiento en animales, cultivos celulares.
Microscopa electrnica e IEM
Hemaglutinacin o hemadsorcin
ELISA
Deteccin inmunolgica (Inmunohistoqumica
Inmunofluorescencia)
PCR y RT-PCR (Mtodos moleculares)
Hibridizacin
Otras pruebas
Cuantificacin Viral (UFP, DICC50%)
AISLAMIENTO
VIRAL

CULTIVO EFECTO DETECCION

CELULAR CITOPATIC POR IF
O

ENFERMEDA IDENTIFICACI
D: N
Parlisis por pruebas
Encefalitis serolgicas
Muerte con
Otros antisueros
ANIMALES DE efectos especficos
LABORATORIO
 A L
R
VI
CO
TI
PA
TO
C I
TO
EC
EF
Para cultivar virus se utilizan tipos especficos de clulas de
cultivo tisular. Los cultivos de clulas primarias se obtienen por
tratamiento de algn rgano animal especfico con tripsina o
colagenasa. Las clulas obtenidas con este mtodo se cultivan en
monocapa (fibroblasto o clulas epiteliales) o en suspensin
(linfocitos) en medios artificiales complementados con suero
bovino o alguna otra de factores de crecimiento. Las clulas
primarias se pueden separar con tripsina, se diluyen y crecen en
nuevas monocapas (subcultivos) para convertirse en
cultivos celulares secundarios.
Las lneas de clulas diploides son cultivos de un nico tipo de
clulas con los que se puede hacer un gran nmero de pases,
aunque finito, antes de presentar signos de senescencia o
experimentar cambios significativos en sus caractersticas.
Las lneas celulares tumorales y las lneas celulares
inmortalizadas, iniciadas a partir de tumores de pacientes o por
efecto de virus o compuestos qumicos respectivamente, se
componen de clulas de un solo tipo que pueden ser sometidas a
pases continuos sin envejecer.
Las clulas primarias de rin de mono son muy adecuadas para
llevar a cabo el
aislamiento del virus de la gripe, paramixovirus, muchos
enterovirus y alguno adenovirus. Las clulas diploides fetales
humanas, que generalmente son fibroblastos, permiten el
 SE denomina efecto citoptico (ECP) a los
cambios bioqumicos y moleculares, morfolgicos y
de viabilidad celular, visibles a microscopa ptica,
causados durante el ciclo de
replicacin viral. Estos efectos se usan para
reconocer las clulas infectadas por virus en un
cultivo.
Los efectos citopticos inducidos por los virus se
pueden examinar con un microscopio de luz
invertida de baja potencia. Se determinan
caractersticas como redondeamiento y contraccin
de las clulas, aumento de la refractabilidad, fusin
o formacin de sincitios, agregacin,
prdida de adherencia y lisis o muerte celular.
EFECTO CITOPATICO
1- CAMBIOS FSICO-QUMICOS
Trastornos en la bomba de Na y K.
2- CAMBIOS METABLICOS
Inhibicin de la sntesis de DNA y RNA
de la clula husped.
Inhibicin de la sntesis proteica.
EFECTO CITOPATICO
3- ALTERACIONES EN LOS LISOSOMAS
Aumento de la permeabilidad.
Ruptura de las organelas.
4- ALTERACIONES EN M. CELULAR
Se expresan Ag virales, lisis por accin
del sistema inmune ante el no reconocimiento
de lo propio.
Fusin de las membranas.
EFECTO CITOPATICO
5- EFECTOS TXICOS
Por acumulacin de viriones o protenas
estructurales del virus.
6- ABERRACIONES CROMOSMICAS
Ruptura simple o mltiple.
7- TRANSFORMACIN CELULAR
Virus tumorales.
 EFECTO CITOPATICO

CAMBIOS MORFOLGICOS
- Tipo de virus
- Sustrato celular (permisividad)
- Condiciones de cultivo
EFECTO CITOPATICO

IN VIVO
Ratones, ratas, cobayos
-Signos nerviosos, muerte
Embriones de pollo
-Muerte (ej. Virus de la E. de Newcastle)
-Retraso de crecimiento
-Hemorragias y edematizacin de Membranas
-Placas necrticas en MCA (ej. Herpesvirus)
-Aumento de viscosidad y color en lquido
alantoideo (ej. Virus Influenza)
EFECTO CITOPATICO

IN VITRO
EFECTO LITICO
REDONDEAMIENTO/GRANULACIN
CITOPLASMTICA
VACUOLIZACIN
SINCICIOS
CUERPOS DE INCLUSIN
EFECTO CITOPATICO

EFECTO LTICO
1- Interferencia de la biosntesis de macromolculas celulares.
2- Alteracin de la funcin de la m.p.
3- Liberacin de enzimas lisosomales
REDONDEAMIENTO-VACUOLIZACIN
1- Aumento de la refringencia celular
2- Prdida de arquitectura
EFECTO CITOPATICO

SINCICIOS
1- Fusin de membranas celulares
2- Clulas gigantes multinucleadas
 EFECTO CITOPATICO

CUERPOS DE INCLUSIN
1- Acmulos de deshechos proteicos (Ag) virales (Herpesvirus)
2- Acmulos de partculas virales
(Poxvirus)
EFECTO CITOPATICO
CUERPOS DE INCLUSIN
1- Intranucleares
(Herpesvirus)
2- Intracitoplasmticos
(Ectima contagioso)
3- Mixtos
(Virus del Sarampin)
ECP LITICO TPICO DE LOS VIRUS DE CICLO
REPLICATIVORPIDO
 EFECTO CITOPATICO

ECP LITICO TPICO DE LOS VIRUS DE

CELULAS RK13 NORMALES CICLO REPLICATIVOLENTO (HERPESVIRUS)
CELULAS RK13 NORMALES SINCICIOS / C. DE INCLUSIN
(TINCION CON HEMATOXILINA-EOSINA) (CLULAS RK13 INFECTADAS CON HERPESVIRUS)
C. DE INCLUSION INTRANUCLEARES
(HERPESVIRUS. EPITELIO PULMONAR)
ECP LITICO (CLULAS VERO INFECTADAS
CON HSV-1, 10X)

CELULAS VERO NORMALES (10X)

 ECP LITICO
CELULAS L929 NORMALES (10X) (CLULAS L929 , PARVOVIRUS DEL RATN)
CULTIVO DE CLULAS DE MONO CULTIVO DE CLULAS DE MONO
NORMALES CON ECP
Mediante el
microscopio invertido
se controla diariamente
el crecimiento
de los cultivos celulares.

Tambin se lo utiliza
para visualizar
el efecto citoptico
(ECP) de los virus
sobre las clulas.
Formacin de
Sincitios H/E
EFECTO CITOPATICO

Efecto citoptico de Enterovirus 71 y Virus Herpes Simple en

cultivos celulares: redondeamiento celular. (Virology
Laboratory, Yale-New Haven Hospital, Linda Stannard, University of
Cape Town)
Formacin de Sincitios en cultivo
celular por Virus respiratorio
Sincicial y Sarampin.
(University of Cape Town, S.A.)
Normal Transformadas por
virus