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6


 

Sustrato

Producto

Prof. Rosanna Citti de Petricone

Cátedra de Microbiología e Inmunología
FCV-UCV
 Pruebas Inmunológicas que
analizan la reacción Ag-Ac

‡ La respuesta inmunitaria de los animales

se puede emplear de dos maneras en un
laboratorio de diagnóstico
± Para identificar un antígeno
± Para detectar anticuerpos en el suero
 Aplicaciónes Diagnósticas de
las Pruebas Inmunológicas
‡ SEROLOGIA
± Medición de las interacciones Ag-Ac con fines
diagnósticos
‡ Principales reactivos empleados en las
Pruebas Serológicas
± Suero sanguíneo (fuente de Ac´s o Ig)
± Suero fresco de cobayo (fuente de C´)
± Antiglobulinas (anti-anticuerpos)
± Anticuerpos monoclonales
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‡ Suero

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‡ Plasma
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 Reactivos Empleados en las
Pruebas Serológicas
‡ Suero

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‡ Antiglobulinas ’  
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 A


.0A


 ‡ Anticuerpos monoclonales
Células esplénicas Fusión con Células de
(Plasmocitos) Polietilenglicol mieloma

’

/
 1
 
 


 
2  
 

Selección de los híbridos

Anticuerpos
en el medio HAT
monoclonales
Hipoxantina, Aminopterina, Timidina
Clonación

Ensayo de producción de anticuerpos

Identificación de clonas positivas
Reclonación de los híbridos positivos
'34
Congelamiento de células para almacenarlas Propagación de clonas seleccionadas
Clasificación de las
Pruebas Serológicas

‡ Pruebas de Unión Primaria

‡ Pruebas de Unión Secundaria
‡ Pruebas Terciarias o en sistemas
vivos
Clasificación de las Pruebas Serológicas

Unión Primaria: Miden captación del Ag por

el Ac

Unión Secundaria: Miden los resultados unión

Ag-Ac V
V

Unión Terciaria: Miden el efecto protector de

los Ac en un aminal.
 Pruebas de Unión Primaria
‡ Combinación de Antígenos y Anticuerpos
  Medir la cantidad de complejos inmunes formados
  Se emplean:
  Colorantes fluorescentes
  Marcadores enzimáticos
  Radioisótopos
  Se separan las complejos inmunes del material no
combinadas
  Se determina la cantidad de marcador presente en
estos
 Pruebas de Unión Primaria

‡ Los Principales grupos de pruebas

de unión primaria son:

1. Radioinmunoanálisis
2. Pruebas de Inmunofluorescencia
3. Pruebas Inmunoenzimáticas
 Pruebas de Unión Primaria
1) Radioinmunoanálisis (RIA)
± Técnica desarrollada en 1960 (Berson & Yallow)
± Capacidad de las proteínas de acoplarse a
radioisótopos:
125I, 3H, 32P, 14C

± Ampliamente utilizado para medir niveles de

un antígeno determinado.
Ej. Fármacos, hormonas en sangre y orina
Aplicación clínica: Test radioalergoabsorbente
(RAST) para medir concentraciones de IgE en
pacientes alérgicos
 Radioinmunoanálisis
Radioinmunoanálisis para detectar Ac (No comp.)
± RAST ± Prueba radioalergoabsorbente (Ig E)
Sumerge en suero problema (x) discos de celulosa
impregnados de Ag y después de lavados, se vuelven a
sumergir en antiglobulina radiomarcada, se mide la
radioactividad del disco y es posible medir la r.a de Ac
presentes en el suero A

A2  L

  5 L

 




L


 Radioinmunoanálisis
Radioinmunoanálisis para detectar (Ag)
(competitivo)
El Ag no marcado desplazará al Ag radiomarcado de los
complejos inmunitarios. Muy sensible. Detecta cantidades
diminutas de fármacos (Morfina en orina) hasta 108 y 1010 M
A,



Ag Ag
marcado Ac marcado A
Ñ

Ñ


  Proteína precipitada




 

   

 


 



Proteína precipitada Proteína precipitada

 Pruebas de Unión Primaria
2) Pruebas de Inmunofluorescencia

± Reacción Ag-Ac se hace visible por

incorporación de colorante fluorescente
Isotiocionato de Fluoresceina-FITC
Rodamina
× 




± Se acoplan fácilmente a moléculas proteícas

± Observación Microscopio de Fluorescencia
 Inmunofluorescencia
Pruebas de Inmunofluorescencia directa
± Prueba directa de Ac Fluorescentes
^ Detecta la presencia de antígenos cuando el nº es pequeño
^ Se emplean frotis de líquidos corporales y cultivos de
tejidos que contienen el Ag. (Virus rábico, virus de leucemia
felina)
V V



   etc.)

A2 6 A  L



   
 Inmunofluorescencia
Pruebas de Inmunofluorescencia indirecta
± Prueba indirecta de Ac Fluorescentes
Detección de anticuerpos en suero o de antígenos
en tejidos o cultivos celulares
A

A2    L

 AcAg 7   




  

L


 Inmunofluorescencia
‡ Citometría de Flujo Principios
Técnica de Ac Fluorescentes
utilizada para detectar Ag.
(Proteínas) en superficie celular
(Fenotipos)
Ej. Poblaciones de Linfocitos

Marcar una suspensión celular con

un Ac monoclonal fluorescente
dirigido contra un Ag específico de
superficie celular (CD)
 CITOMETRÍA DE FLUJO

Principios del funcionamiento del Citómetro de Flujo

 CITOMETRÍA DE FLUJO
‡ Patrón que se observa en un citómetro de flujo
Empleando Ac con diferentes marcadores fluorescentes puede
analizarse de manera simultánea la expresión de diversos Ag. de
superficie (CD)
Pruebas de Unión Primaria
3) Pruebas Inmunoenzimáticas
Detecta y cuantifica Ag (Ag en solución) como Ac
Utiliza enzimas que se acoplan a Ac específicos u otras
proteínas
± Reacción enzima-sustrato (covalente)
Reacción colorimétrica (sustrato incoloro
sustrato color)
± Intensidad de color
Directamente proporcional a la cantidad de
complejos Ag-Ac formados
± Aplicaciones clínicas:
Diagnóstico enfermedades bacterianas, virales y
prasitarias
PRUEBAS INMUNOENZIMÁTICAS
‡ Marcadores enzimáticos empleados
± Se han empleado 20 enzimas diferentes
± Las más populares:
Fosfatasa alcalina
Peroxidasa de rábano picante
Beta galactosidasa
± No costosas y fáciles
± Producción de productos luminiscentes o
fluorescentes:
Ej. Luciferasa
Pruebas de Unión Primaria
Pruebas Inmunoenzimáticas
a)Ensayos Inmunoabsorbentes ligados a enzima
(ELISA)
1) Prueba indirecta de Elisa
2) Elisa en sandwich
3) Elisa con Ag marcado
b)Técnicas de Inmunoperoxidasa
c) Inmunoelectrotransferencia (´
V )
d) Inmunoanálisis de AVIDINA-BIOTINA
 1) ELISA INDIRECTO
Pruebas Inmunoenzimáticas
(ELISA Indirecto)
Detecta Ac.
± Intensidad del color
Simple vista ó
espectrofotometría
 1) ELISA INDIRECTO
ELISA indirecto (Detecta Ac)

Antígeno Antígeno Antígeno Antígeno

+ + +
Suero problema Suero problema Suero problema
+ +
Antiglobulina + Antiglobulina-
enzima enzima
+
sustrato
 2) ELISA SANDWICH
Pruebas Inmunoenzimáticas
± (ELISA sandwich)
Se detecta ó
cuantifican Ag
Ej. detectar en
sangre el virus
de la Leucemia
felina
Ac.
p
cífico

Ac
captura
3) ELISA ANTIGENO MARCADO
Pruebas Inmunoenzimáticas
± (ELISA Ag marcado)

± Detecta Ac
± La más comercial
± Funciona en sangre
entera
b)TÉCNICAS DE INMUNOPEROXIDASA

Pruebas Inmunoenzimáticas
± Se observa con M. optico
± Emplea enzimas conjugadas
a Ig o antiglobulina para
detección de Ag en tejidos
Marcadores:
Peroxidasa de rábano picante
Fosfatasa Alcalina
ȕ-galactosidasa B
Ej.  V

 (perro)
 c)´



3) Pruebas Inmunoenzimáticas (Transferencia Proteínas)
± Inmunoelectrotransferencia (´
V )
Detecta Ag mezclado con otros Ags. (Posición
diferentes Proteinas, dependerá del tamaño molecular)
1º Etapa: Electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS)
 c) ´



3) Pruebas Inmunoenzimáticas
Inmunoelectrotransferencia (´
V )
2º Etapa: Electrotransferencia del gel a un papel
3º Etapa: Visualizacion de los Ag transferidos

Electrotransferencia

Inmuno
revelado
 d) INMUNOANÁLISIS AVIDINA-BIOTINA

‡ 3) Pruebas Inmunoenzimáticas
± Biotina: mol. peqeña
se une a proteína Avidina

Avidina: proteína pequeña

presente en la clara huevo
que se une con fuerza a la
Biotina, y se conjuga
con la peroxidasa de
rabano
 Desventajas de la Pruebas
enzimáticas
‡ Radioisotopos tienen vida media corta
‡ Son peligrosos (radioactivos)
‡ Necesitan dispositivos medición caros

‡ Las Enzimas son estábles y baratas

‡ Pierden actividad enzimática al conjugarlos
con antiglobulinas
‡ Inhiben la actividad de los Ac.
 ACCIDENTE TRAGICO

Por quedarse dormido en clase« se fue de cabeza

Pruebas de Unión Secundaria
‡ Miden los resultados de la unión Ag-Ac V
V
‡ La reacción antígeno-anticuerpo por lo general va
seguida de una segunda reacción
‡ Pruebas de dos etapas:

1º Etapa Interacción Ag-Ac (uniones covalentes)

2º Etapa Determinada por el estado físico del Ag

a) Ag. Soluble PRECIPITACIÓN

b) Ag. Párticulas (bacterias, eritrocitos) AGLUTINACIÓN

3º Etapa Ac activa la vía clásica del Complemento

Ag. Se encuentra sobre superficie celular
LISIS CELULAR
Pruebas de Unión Secundaria
‡ La reacción Ag-
Ac por lo general
va seguida de
una segunda
reacción
determinada por
el estado físico
del antígeno
Pruebas de Unión Secundaria
1) Precipitación
± Inmunodifusión
± Inmunoelectroforesis y técnicas afines
2) Aglutinación
± Pruebas de antiglobulina
± Aglutinación pasiva
3) Hemaglutinación viral (HA) y su inhibición de la HA
(HI)

4) Pruebas de Fijación del Complemento

± Pruebas de citotoxicidad
 PRECIPITACIÓN
‡ Curva de Precipitación cuantitativa

Ag soluble + Antisuero

Mezcla (flocula)
‡ Mecanismo de Precipitación
Agolubl
canti a contant
Ac
 INMUNODIFUSION
Inmunodifusión ó difusión en gel
Inmunodifusión Radial

Inmunodifusión Doble

Ag A Ag A

Ac Anti A
Pruebas de Unión Secundaria
‡ Precipitación: Inmunodifusión
± Inmunodifusión doble

IMPORTANTE EN VETERINARIA:
‡Detectar Ac en suero contra el virus de la Anemia Infecciosa Equina
(Tests de Coggin)

‡Detectar animales infectados con el virus de la Leucemia bovina

Pruebas de Unión Secundaria
Inmunodifusión Doble

6i las 2 lineas se unen, es que los Ag

son idénticos 6i se fusionan y forman un espolón es que
un Ag tiene Epítopos que no existe en el otro

6i las lineas se cruzan es que los 2 Ag son diferenes

 INMUNOELECTROFORESIS
‡ Precipitación: Inmunoelectroforesis
(Identifica proteinas de liquidos
corporales)
Pruebas de Unión Secundaria
‡ AGLUTINACIÓN
‡ Ac (bivalentes) establecen enlaces cruzados con Ags particulados
(bacterias o eritrocitos) extraños, haciendo que se aglutinen
‡ Más sensible que la Precipitación
Ig G Ig M Ig A
Aglutinación + +++ +
Precipitación +++ + +/-
Neutralización + + +

Amontonamiento de Ag
(Aglutinación½
Ag particulado
INHIBICIÓN DE LA HEMAGLUTINACIÓN
HEMAGLUTINACIÓN (HA) PASIVA
‡Detecta Ac frente a Ag de eritrocitos
y frente a Ag que no se encuentran
en la superficie de los eritrocitos
(eritrocitos sensibilizados)
‡ Caracteriza virus desconocidos
INHIBICIÓN DE LA HA
‡ Mide conc. de Ac en suero contra
un virus
‡ Identifica un virus específico
‡ Virus muy hemoaglutinantes:
(Ortomyxovirus, Paramyxovirus,
Alfavirus, Flavivirus, Bunyavirus
 Pruebas Terciarias- Pruebas en
sistemas vivos
‡ Pruebas de NEUTRALIZACIÓN
  Capacidad del Ac de anular la actividad biológica del Ag
cuando se mezcla con él V
V


  Altamente sensibles y específicas
l Identificar toxinas bacterianas (Toxina Į del 

V )
l Identificar partículas virales desconocidas o títulos de Ac
antivirales específicos

‡ Pruebas de PROTECCIÓN
± Análisis de neutralización que se realiza totalmente V
V
Mide las eficacia terapéutica de un antisuero específico
Administrar diluciones crecientes de Ac, retando posteriormente
con dosis estándar de M.O patógeno o toxina.
± Dosis de inoculación: LD50, ID50
± Efecto protector de un antisuero: PD50