ANALITIKE METODE-

EERI I NPN SPOJEVI

Farmaceutski fakultet
Sarajevo
Aplikacije-odreivanje koncentracije
glukoze
Mjeri se u:
Serum
Plazma
Puna krv
Urin
CSF
Skupljanje i pohranjivanje uzoraka

Glukoza u punoj krvi oko 12-15% niza od

vrijednosti u plazmi(zbog nizeg sadrzaja vode)

Arterijska > kapilarna > venska

Uslijed perifernog klirensa

Glikoliza uzrokuje pad glukoze u serumu 5-

7% / sat kod necentrifugirane krvi na sobnoj
temperaturi.
Visi nivo kod leukocitoze, pri bakterijskoj
kontaminaciji
Skupljanje i skladistenje uzoraka

Stabilna u separiranom serumu 8 sati 8 sati pri RT

Glikoliza je inhibirana putem NaF. F gradi komplekse

sa Mg and Po4, izaziva interference sa enolazom. I
fruktozo 1,6 difosfatazom.

F je slab antikoagulant (vezuje Ca) treba dodati

K2C2O4- za jaci antikoagulantni efekat.
CSF sa bakterijama,analizirati odmah

Urin. Izmjeriti na pH 4
Struktura
D ili L se odnosi na poziciju OH grupe na C
atomu&najblizi zadnjem. Veina secera je u D formi.

(desno) ili (lijevo) odnosi se na poziciju OH grupe

na prvom C atomu.
Struktura

Ekvilibrij 36%, 54%.

Glukozo oksidaza/ metoda specificna za -D glukozu.

Kalibrirajuce solucije treba ostaviti 2 sata da bi se
postigla ravnoteza
 Heksokinaza

Referentna metoda, uz deproteinizaciju uzorka

Heksokinaza
Glukoza +ATP G-6-P + ADP
G-6-PD
G-6P + NADP+ 6-fosfoglukonat + NADPH + H+
Heksokinaza

Glukoza se fosforilira putem ATP.a u prisustvu heksokinaze i

Mg2+
G-6-P se oksiduje putem G-6-PD u 6-fosfoglukonat u
prisustvu NADP+. NADPH koji se producira je proporcionalan
koncentraciji glukoze koja se mjeri na 340nm
Heksokinaza
Deproteinizacija barijum hidroksid I cink sulfat

Interference< Hemoliza (>0.5g Hb)./interference

fosfatnih estera I enzima
Bilirubin, odredeni lijekovi, fruktoza i
lipemija. Potrebna slijepa proba.

Indikator reakcije dostupne za vidljivo podrucje

2.PMS*fenazin metasulfat i substituirana
tetrazolium sol/reakcija sa NADPH
Redukcija INT//mjerenje na 520 nm
Glukozo oksidaza
Enzim specifican za beta D glukozu

Glukozo oksidaza katalizira oksidaciju glukoze u

glukonsku kiselinu I vodik peroksid

GOD

Glukoza + 2H2O glukonska kiselina + 2 H2O2

Interference od hemolize i triglicerida. Glutation i
Vitamin C , mokrana kiselina, bilirubin, tetraciklin
Glukozo oksidaza

Peroksidaza se doda u prisustvu hromogenog o2

akceptora
peroksidaza
o-dianisidin + H2O2 oksidirani o-dianisidin + H2O

Druga faza se da modificirati uz koritenje o2

elektroda (mjeri se brzina utroka kiseonika), ali je
prethodno potrebno inhibirati produkciju o2 od
strane endogene katalaze
Glukozo oksidaza

.YSI glukozo metar (puna krv ili serum)

Imobilizirani GOD na sendvi membrani. Puferovana
glukoza difunduje du membrane, reagira s GOD i
producira H2O2, koji difunduje du druge mebrane, i
oksiduje se na platinum anodi
H2O22H+ +O2 +2e-
Glukozo oksidaza

Strujno kolo zavrava sa srebrenom katodom gdje dolazi

do redukcije kiseonika u vodu

4e- + 4H+ +O2 2H2O

H2O2 koji difunduje natrag u komoru za uzorke se razori

putem katalaze
Glukozo dehidrogenaza

glukozo dehidrogenaza
Glukoza+NAD_____> d glukono-delta lakton
+
+NADH+H

Mutarotaza se doda za brze postizanje stanja ravnotee.

Primjena rijetka : Kontinuirani i centrifugalni analizatori

Test kitovi esta opcija na tritu SAD,a ne i Evrope

Historijski

Glukozo dehidrogenaza (bacillus cereus)

o-Toluidin+ glukoza------kompleks hromogen

plavo zelen. 680 nm
Galaktoza interferira jako, pentoze interference
na 480 nm

Metode zasnovane na principu oksidoredukcije

(Cu 2+, Zn2+ and Fe3+)
Kako dobro se analitiki mjeri glukoza?

3.3 mmol/l cv 3.1

6.6 mmol/l cv 2.3
Glikozilirani hemoglobin *monitoring

Produkt glikozilacije neenzimatske

Reakcija se odvija u eritrocitu koga odlikuje

kompletna permeabilnost za glukozu

HbA1 sastavljen iz 4 komponente HbA1a1, HbA1a2

te HbA1b i HbA1c
Svaki od hemoglobina sastavljen od labilne komponente
(aldimin) i stabilne (ketamin)

Normoglikemina osoba ima> 0,4-0,8 % HbA1a1+HbA1a2+ HbA1b u odnosu na ukup

Hb
Ukupni HbA1c=5 do7%., procenat stabilne komponente 96,8%

Dijabetiar : znatno vie HbA1c 7,5+-2,0, procenat stabilne komponente 93,1 %

HbA1a1 je fruktozo-1, 6 difosfat vezan za
amino terminal beta lanca

i HbA1a2 je glukozo-6-fosfat vezan za amino

terminal beta lanca.

HbA1b je piruvat vezan za amino terminal

valina beta lanca

HbA1c ini 80% HbA1.

.
 Aldimine Ketoamine
Schiff base
NH2 H-C=O H-C=N- A H-C-NH- A

A +
H-C-OH H-C-OH H-C=O
N terminal
Glucose Glucose Glucose

HbA + glucose Pre-HbA1c HbA1c

rapid slow
Stvaranje IFOVE BAZE)- nastavak glikozilirani Hb

1.Glukoza+ amino grupa valina iz HbA-------Nestabilna ifova baza

2.Nestabilna ifova baza______Amadori rearanman------Ketoamin

PRINCIP KOLORIMETRIJSKIH METODA;

1.HbA1c-----kisela hidroliza-----oslobaanje 5 hidroksimetilfurfurala

(5HMF)

2.5HMF+Tiobarbiturna kiselina-----------stvaranje obojenog produkta

Antikoagulans: EDTA, hemolizat startni materijal uz koritenje

agensa za lizu
Jonoizmjenjivaka hromatografija

Odreuje HBA1 ukupni glikozilirani

hemoglobin (A1a + 1b + 1c)
HPLC I HbA1c i HbA1
Elektroforeza- HbA1c , ali manje
specifina .
.
Uzorak: EDTA krv, stabilna 1 nedjelju na 4C
HbA1c-vrijeme poluraspada je 35 dana
1% rastb HA1c je ekvivalentan rastu
koncentracije glukoze od 35 mg/dL.
Clin Chem 2009; 55: 1612-14
HbA1c bi trebao biti dijagnostiki test za dijabetes.
Vrijednost od 6.5% taka odluke
6.0-6.4% -osobe imaju visok rizik za razvoj
dijabetesa
DCCT HbA1c IFCC-HbA1c
(%) (mmol/mol)
6.0 42
6.5 48
7.0 53
7.5 59
8.0 64
9.0 75
Referentni intervali
< 6.5 % normalan
6.5-7.0 % cilj kod dijabetiara
7.0 -9.0% suboptimalna kontrola diabetesa
> 9.0 % loa kontrola diabetesa
Interference
Ikterus :
Lipemia
Hemoglobinske variante S i C nemaju efekte kod
heterozigota.
Kod homozigota Hb SS ili Hb CC pacijenti nemaju
HbA prisutan niti HbA1c primjeniti druge kriterije.

HbF lnivo do 30 % ne interferira

METODE ODREIVANJA INZULINA

1.RIA interference:endogena antiinsulinska

antitijela

2.Imunoenzimometrijski esej(IEMA)

Insulin vezan za At imobiliziran na magnetni vrsti suport.Dodaje

se drugo At obiljeeno sa ALP i nagradi sendvi. Potom se
dodaje fluorogeni substrat nakon ispiranja u svrhe uklanjanja
nevezanog At.

3.Enzimski imunoesej sa mikroesticama(MEIA)

Insulin vezan za antiinsulin obloene mikroestice koje se prebace

na matriks sa staklenim vlaknima)-(glas fiber), ovdje se dodaje anti
insulin ALP konjugat i gradi sendvi kompleks.
4-metilumbeliferil fosfat je substrat za ALP.
Hipoglikemija

Koncentracija glukoze ispod nivoa kod gladovanja

Bez specificnih simptoma, indukcija odgovora simpatikusa

Oslobadjanje adrenalina sa simptomima hipoglikemije

Slabost, tremor,znojenje, brz puls,glad, epigastricni diskomfor
Slicnosti >hipertiroidizam, feohromocitom

Ovisnost mozga/neuroglikopenija*glavobolja, konfuzija, letargija, gubitak svijesti

Uzroci hipoglikemije kod odraslih

A.Lijekovi E. Insulinome
B.Toksini/alkohol* F.Nepankreasne neoplazme
C.Ozbiljna disfunkcija jetre g.hronicno obolenje bubrega
D.Deficit hormona*glikokortikoidi, hormon rasta h.reaktivno
Hipoglikemija kod djece> Neonatusi

Ketotska hipoglikemija
Mali za gestacionu dob
Kongenitalni defekti enzima Respiratorni distres sindrom
Obolenje skladistenja glikogena DM kod majke
Nedostatak glikoneogenicnih enzima Toksemija trudnoce
Galaktozemija Drugi uzroci*stres hladnoce
Nasljedna netolerancija na fruktozu
Hipesenzitivnost na leucin
Endogeni hiperinsulinizam
Reyes sindrom
Idiopatska
Drugi tip klasifikacije hipoglikemije

a) na stimulus-reaktivna hipoglikemija
Viak inzulina, redukcija GLIKONEOGENEZE

b) postprandijalna-par sati nakon objeda

Odgovor na postspontana hipoglikemija

DIJAGNOSTIKA:

Glukoza ispod 2,8 mmol/L., provjera svaka 4 sata

Klasini testovi:

1.12 sati nakon gladovanja niske vrijednosti za

glukozu
2.Nakon 5 sati test tolerancije na glukozu
3.Nivo inzulina-kod utvrdjivanja vika produkcije
(tumor)
Nakon 72 sata inzulin/glukoza ispod 0,3
4.Odreivanje C PEPTIDA
OSTALI TESTOVI

A) Proinzulin---osnovni
Proinzulin oblik skladitenja inzulina(10% potencije)
inzulina
Proinzulin___________31 AK+ inzulin
Nivoi C peptida vei 5-10 puta u gladovanju o nivoa inzulina

Proinzulin-----visoke koncentracije kod pacijenata sa benignim i

malignim tumorima beta elija

Klinika slika: rast inzulina, rast C peptida,rast proinzulina

B) C peptid

Evaluacija hipoglikemije, bazalni nivo orijentir sekretornog

kapaciteta kod pacijenata za inzulin, raditi kod pacijenata sa
hirurkim intervencijama na pankreasu(nedetektabilan),
raste nakon transplantacije pankreasa
C) Inzulin-evaluacija
Inzulin pacijenata sa hipoglikemijom

Dobar kod identifikacije pacijenata sa dijabetesom koji trebaju

tretman inzulinom u dnosu na one koji to rijeavaju dijetom

NIJE PREPORUENO KORITENJE INZULINA ILI C

PEPTIDA KOD PACIJENATA SA DM.!!!!

D)TOLBUTAMID TEST

Stimulira pankreas na luenje izulina

Aplikacija intravenski, mjerenje koncentracije glukoze u periodu
od 2 sata, glukoza opada za 50%
Diferencira inzulinome od hiperinzulineminih stanja
ANALITIKA NPN
SPOJEVA
 1-2%/dan kreatina miia prevede se u kreatinin
Producirana koliina je vezana za miinu masu
Sloba filtracija preko glomerula
Neto tubularne ekskrecije.
Koncentracija kreatinina u plazmi
Potekoe

Koncentracija ovisi od bilansa input i output.

Produkcija uvjetovana miinom masom, a u ovisnosti od
godina starosti, spola,i tjelesne mase.
Visoka varijabilnost izmeu individua, a niska u sklopu
jedne individue.
Koncentracija se nalazi u inverznom odnosu sa GFR-om.
Male promjene u koncentraciji kreatinina u sklopu referentnih
vrijednosti = velike promjene u brzini GFR.
Referentne vrijednosti mogu ponekad navesti na
pogrene interpretacije
Problemi vezani za koritenje koncentracije plazma
kreatinina post Grad Med J 1988;64:204-208
Formule se samo odnose na stanje ravnotee. Neprimjenjljive su kod
akutnog oteenja bubrega

Stabilna funkcija bubrega mora biti 4 dana

Plazma kreatinin raste nakon obroka bogatih proteinima.

Efekat gulaa. .,80% rast kreatinina nakon 300g kuhane govedine.
<Manje varijacije u koncentraciji kreatinina u ranim jutarnjim satima

Intenzivne vjebe mogu dovesti do rasta kreatinina od 14%

Masa miia tea za predvidjeti kod edematoznih pacijenata i u kasnoj

trudnoi

Pacijenti sa problemima na razini miia( muscle wasting)

Pacijenti sa obolenjem jetre
Lijekovi koji inhibiraju tubularnu sekreciju mogu uzrokovati rast
koncentracije kreatinina.
 Efekat miine mase na koncentraciju kreatinina u serumu
Poveana
Normalna Normalna Miina Reducirana miina
Miina Miina Masa masa
Masa Masa
Kreatinin
Input
Plasma
Pool
sadraj
Output
Bubreg

Normalan Oboljeli Normalan Oboljeli

Bubreg Bubreg bubreg Bubreg
 Odreivanje kreatinina
H
N
O- -
O NH
NH
O2 N NO2 O2N
H3C OH-
NH + CH3
-
O NO2

O
NO2

Creatinine Picric acid O2N

Janovski complex
max= 485 nm

Reakcija kreatinina i alkalnog pikrata opisana 1886 putem

Max Eduard Jaffe.
Mnogo drugih substancija reagira sa pikratom.
Proteini,glukoza,vit
c,gvanidin,aceton,cefalosporini,acetoacetat,piruvat
Jaffeova metoda:
Problemi:
A)nespecifinost metode
B)spektralne interference
C)nestandardizirana kalibracija metode
Substancije koje produkuju pikrate:proteini, glukoza,
askorbinska kiselina,keto tijela, piruvat,gvanidin te
cefalosporini
Interferiraji i bilirubin,hemoglobin i lipemija
Validacija za sve metode: metoda ID-MS.
Modifikacije Jaffe metode

Fullerova zemlja (aluminij silikat, Lloyd

reagens)
Adsorbuje kreatinin i eliminira interference od
proteina
Kisela slijepa proba
Nakon razvijanja boje., disocira kompleks po
Janowskom
Pre-oksidacija
Dodavanje fericijijanida oksiduje bilirubin
Kinetika Jaffe metoda
Brzo reagujui piruvat,glukoza,askorbat)
Absorbanca ( = 520 nm)

A
rate
t

Sporo regujui protein

A

kreatinin (i -keto kiseline)

0 20 80
vrijeme (sec)
 Enzimatska metoda kreatinin I
CH3 CH3
H COOH
Creatinine N-Methylhydantoin
N N N
iminohydrolase amidohydrolase
H
NH O N
C
N N O CH3
O H O H
Creatinine N-Methylhydantoin N-Carbamoylsarcosine

H COOH N-Carbamoylsarcosine Sarcosine

N amidohydrolase H oxidase H2N COOH
H N COOH C + CH2O
C N H3C H2
O CH3 H2O H2O2
NH3 + CO2
N-Carbamoylsarcosine Sarcosine Glycine

H2O2 se mjeri konvencionalnom peroksidaza/boja

metodom

Kreatinin iminohidrolaza poznata kao kreatininaza

 Enzimatska kreatinin metoda II
CH3 CH3
Creatinine Creatine
N H
amidohydrolase N NH amidohydrolase
N COOH
NH H3C
N COOH NH2
O H
Urea
Creatinine Creatine Sarcosine

Sarcosine
H H2N COOH
N oxidase C + CH2O
COOH
H3C H2
Sarcosine O2 H2O2 Glycine

H2O2 se mjeri preko peroksidaze/boja

Kreatinin-analitika metoda III

1.Kreatinin+H2Okreatin
kreatin hidrolaza

2.Kreatin+ATP kreatin fosfat+ADP

kreatin kinaza

3.ADP+fosfoenolpiruvat ATP+piruvat
piruvat kinaza

4.Piruvat+NADH+H+ Laktat+NAD+
LDH
 Kreatinin-enzimska metoda IV
iminohidrolaza
1.Kreatinin---------------- N-metilhidantoin+NH3

Dalje odreivanje preko amonijaka

a)Kolorimetrija
b)Enzimski
c)Jonoselektivne elektrode

HPLC-referentna metoda
Hromatografska separacija kreatinina,potom apsorbcija
Na 200 nm

Masena spektroskopija-definitivna metoda,uv detekcija 234

nm
Referentne vrijednosti kreatinin:

62-115umol/L kod mukaraca

53-97umol/L kod ena

KREATIN U TJ:TENOSTIMA

1.Nestabilan je na alkalnom i kiselom pH i brzo se podvrgava

konverziji u kreatinin

2.Kreatin u urinu-razlika izmeu prethodno formiranog kreatinina i

ukupne koncentracije kreatinin hromogena nakon to se uzorak
podvrgne kondenzaciji sa kiselinom

3. Mala dijagnostika vrijednost

Nekad koriten test u urinu kod miine distrofije
75% ukupnog NPN se izlui kao ureja

90% ureje-luenje preko bubrega

Niti se reapsorbuje niti lui putem tubula

Slobodno se filtrira glomerulima

40%-70% ponovo ue u plazmu

Klirens ureje ne daje realnu sliku o brzini glomerularne filtracije

Sinteza ureje je esencijalna za ljude jer:

U naoj dijeti potrebni su proteini jer daju amino kiseline

Aminokiseline ne mogu se skladititi, za razliku od masti i

ugljenih hidrata

Viak azota nakon konverzije u amonijak se mora izluiti

kao ureja ili e
cirkulirati u krvi i biti toksian ako naraste do tog nivoa

Nije optimalna za ptice i reptile

Ekskrecija zahtjeva veliki gubitak vode, tako da ovi organizmi

eliminiraju kristalnu mokranu kiselinu.
KUD IDE NITROGEN
Amonijak iz tkiva se transportuje
putem glutamina u krvotok

Metabolizam amino kiselina se

odvija u jetri.
U citozolu alfa ketoglutarat se
pretvara u glutamat

Glutamat i glutamin ulaze u

Mitohondrije jetre i dalje se
Metaboliu.
Drugi nacin da amonijak dospije u jetru
Efikasnost konverzije amonijaka u ureju

Referentne vrijednosti: 2,5-6,4 mmol/L

Kako se uklanja toksicni amonijak!
Amonijak/NH3

Nastaje dezaminacijom AK

ini 04, do 0,5% NPNa

Rast koncentracije:

Oteenja jetre
Hepatika koma
Krvarenja
Promjene u acidozi i alkalozi na razini urina
NH4+ je toksian za ivotinje

Visoki nivoi NH4+ za CNS su toksini i uzrokuju

komu ismrt.

Oslobaanje od vika NH4+ iz mozga moe

uzrokovati redukciju alfa ketoglutarata i inhibirati
TCA ciklus. No,glutamin i GABA su neurotransmiteri.

Mozak mora imati visoku koncentraciju ATP-a !

Zato?
Ureja ciklus
Plazma ureja raste:
1) Fizioloki(dijeta bogata proteinima)

2) Patoloki:

3. a) Prerenalna etiologija-katabolika stanja, dehidratacija,

cirkulatorni poremeaji (srce,ok , hemoragija)

b)Renalna-renalni problemi,akutni ili hronini

(GFR mora opasti za 50%)

c)Postrenalna-opstruktivna nefropatija bilo gdje u

urinarnom traktu(kamenci,tumori prostate,infekcije)
Prerenalna azotemija

Rast koncentracije ureje bez rasta kreatinina

Postrenalna azotemija

Rast koncentracije ureje(vie raste) i rast koncentracije kreatinina

Razlog:obstrukcija protoka urina, pritisak na tubule
Plazma ureja opada:

1.Fizioloki-niski proteini,(gladovanje), trudnoa

2) Artefact-loe sakupljanje uzoraka

3)Patoloki vezani za sekreciju ADH,hepatiki nedostatak

4.Terapeutski-prolongirana terapija iv tenou.

 Odreivanje ureje(direktno)

O
O O
O
CH3
+
H CH3 H+,
+ N N
H3C H3C
H2N NH2
NOH O
H3C CH3
Diacetyl monoxime Diacetyl Urea Diazone
max= 540 nm

Direktne metode mjere hromogen koji se producira

iz ureje direktno.(metoda krajnje take)
Indirektne metode mjere amonijak koji nastaje iz
ureje
Direktno odreivanje-metoda II

Ureja+ortoftalilaldehid+H+----------izoindolin

Izoindolin+8-(4 amino-1-metilamino)6metoksihinolin
---------------------------------------------
Nastanak hromofora 510nm
Odreivanje ureje(indirektna metoda)
OH

H2N NH2 N
-
Urease OH
2 NH4+ +

O -
O O
Urea Phenol Indophenol
max = 560 nm

Druga faza je Berthelot reakcija

U SAD, ureja se konstantno raportira kao
Blood Urea Nitrogen (BUN), ak i kad . . .
Se ne mjeri u krvi (odreuje se u serumu)
Urea je ta koja se odreuje, ne azot
Reakcija po Berthelotu-faze

ureaza
Ureja (NH4)2CO3

pH=10,5

NH4+ +hipohloritkloramin+H3O+

H2NCl+ fenol--------bazna sredina kvinonhloramin

Kvinonkloramin+fenol u viku indofenol(plav)

Ostale reakcije koje ukljuuju ureazu

1.Preko amonijaka- optiki test

NH4++alfaketoglutarna
kiselina+NADH+ADP-------------
>NAD+glutaminska kiselina
Glut DH

2.Konduktometrija

3.Jonoselektivne elektrode----od istraivakog

interesa

Detekcija uz primjenu potenciometrije

Stara metoda-neslerizacija

2(HgI2+2KI)+NH4++NaOH------>NH2Hg2I3+H++4KI+NH4I
utonaranasti koloid

ANALITIKA AMONIJAKA

1.Difuzija Konvej, oslobaanje amonijaka,titracija

amonijaka sa kiselinom
2.Neslerizacija
3.Jonoizmjenjivaka kromatografija-----Berthelot reakcija
4.Jonoselektivne elektrode-potenciometrija
5.Enzimatske metode(kinetike)-rf ureja
Konverzija urea/BUN

28 mg N / mmol urea
BUN mg / dL urea (mg / L) 0.1 dL / L
60 mg urea / mmol
60 mg urea / mmol
Urea mg / L BUN (mg / dL) 10 L / dL
28 mg N / mmol urea
Mokrana kiselinaIUPAC name

7,9-dihidro-1H-purin-
2,6,8(3H)-trione

drugo ime 2,6,8 Trioksipurin

MOKRANA KISELINA
Uklanja se iz krvi filtracijom putem bubrega-98% filtrirane
se ponovo reapsorbuje
2/3 do izlui se ili eliminira putem bubrega,ostatak
se metabolie u GIT u CO2 i NH3.
Ekskrecija i loa rastvorljivost razlozi zato je prisutna u
niskim koncentracijama u plazmi
Ali i patologija
Izvori purina:
A) Dijeta(30% izluene koliine)
B)denovo sinteza iz prekurzora u organizmu-jetra(R5P+Pi)
C)salvage put(iz adenina i gvanina te hipoksantina)
Hiperurikemija Vea MK od 420umol/L kod ena
od 360umol/L kod mukaraca
Esencijalna(asocirana sa hiperacidurijom)
Smanjena ekskrecija(asocirana sa normalnom ili smanjenom
bubrenom ekskrecijom mokrane kiseline)
Bubrena retencija
Zatajenje bubrega
Terapija lijekovima:diuretici, salicilati,pirazinamid,etambutol
Otrovi:olovo,alkohol
Organska acidurija
Endokrinopatije(hipotiroidizam., hiperparatiroidizam)
Povean obrt nukleinskih kiselina
Mijeloproliferativni sindrom
Hemoterapija malignih tumora
Specifini enzimski defekti
Deficit enzima hipoksantin gvanin fosforibozil transferaze
/Lesh Nyhan sindrom(djelomini ili potpuni)
Abnormalna aktivnost fosforibozil pirofosfat sintetaze
Von Gierke(deficit G6 fosfataze-indirektni efekti)-povean metabolizam G6P u
R5P.
 Hipourikemija
Koncentracija urata u serumu manja od 120 umol
Uzroci:

1.Ozbiljno hepatocelularno obolenje sa reduciranom sintezom purina

ili smanjenom aktivnou ksantin oksidaze

2. Defekt u bubrenoj tubularnoj reapsorbciji mokrane kiseline

kongenitalni poremeaj(Fanconi) ili steeni poremeaj

3.Akutni poremeaj-injiciranje kontarstnog medija ili pak hronini zbog

izlaganja toksinim agensima.

4.Tretman hiperurikemije(alopurinol ), kancer kemoterapija sa 6

merkaptopurinom ili azatioprinom(inhibitor de nuovo purin sinteze)
 Odreivanje mokrane kiseline
Metoda sa fosfotungstatom
O
Phosphotungstic acid Tungsten blue O H
N N
HN H2N
O- O

O N N O2 H2O2 N
H O N H
H H
Uric Acid Allantoin

Tungsten plavo absorbuje na = 650-700 nm

Urikaza katalizira istu reakciju i specifinija je.
Absorbanca mokrane kiseline na 585 nm se
monitorira
.
Proteini prisutni u fazi razvijanja boje-kvening
Uklanjanje proteina obavezno

Interference(FT metoda):

glukoza, askorbinska kiselina u plazmi ili urinu I glutation,ergotionin,

cistein isplavio u plazmu kao posljedica hemolize

2. Metode sa urikazom
Metode zasnovane na mjerenju H2O2 su este
Isti princip reakcije kao FT
Dalje:
katalaza

H2O2+ metanolFormaldehid+2H2O

Formaldehid+acetilaceton+NH3 3H2O+3,5 diacetil-1,4 dihidrolutidi

3. Metode sa peroksidazom

Akceptori kiseonika:

3 metil-2-benzotiazolinon hidrazon
O dianisidin
4 aminofenazon sa fenolom ili substituiranim fenolima

4.HPLC-254 nm
Amino kiseline

Normalna reapsorbcija u glomerularnom filtratu na nivou

proksimalnih tubula

Prisutne u urinu u viku kada koncentracija u plazmi premai

maksimum

a) Specifini nedostatak u normalnom tubularnom mehanizmu reapsorbcije

b)Nasljedna metabolika obolenja -Cistinurija

c)Steeno bubreno tubularno obolenje

ODREIVANJE AMINOKISELINA

Deproteinizacija
Zagrijavanje filtrata
pH=10

1.Amino kiseline+1-fluoro-2,4 dinitrobenzol 1-aminoacil 2,4 dinitrobenzol

420nm

2.Reakcija sa ninhidrinom
pH=3-4
Ninhidrin+aminokiseline hidridantin+RCOH+CO2+NH3

Ninhidrin+NH3+hidridantin------------------obojeni kompleks crven,plav

Ili ut(prolin, oksiprolin)