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UNIVERSIDAD NACIONAL

AUTNOMA DE MXICO
FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES
ZARAGOZA

Formulacin
del Medio
ALUMNOS:

Buenda Ros Alma Rosa


Cervantes Mrquez Sandra Gmez Bravo Claudia
Patricia
Hernndez Prez Mario Hernndez Ros Tlakaelel Laboratorio de Microbiologa
Jurez Gmez Luz Nallely Industrial
Grupo:2901 Semestre:
2013-2
Objetivo
Comparar diferentes fuentes de
nitrgeno necesarias para el
crecimiento microbiano utilizando
mtodos analticos para evaluar
dicho crecimiento.
Medio de cultivo
Los medios de cultivo usados para hacer crecer
los microorganismos han de tener todos los
elementos necesarios en la forma y las
proporciones adecuadas para la sntesis de
material celular y la produccin de metabolitos.
En un laboratorio se pueden usar productos
qumicos, de composicin conocida, para la
obtencin de medios de cultivo, que son medios
sintticos, pero en las fermentaciones industriales
los medios han de ser lo ms baratos posibles.
Crecimiento microbiano
Se entiende por crecimiento la sntesis de
nuevos materiales celulares, cuya
consecuencia aparente es un aumento en el
tamao o volumen celular.
En el caso de microorganismos, se refiere a la
multiplicacin celular. En este sentido es como
se ha tomado para analizar las fases diferentes
que comprende el fenmeno de la
multiplicacin microbiana.
Medios de cultivo para
fermentacin a nivel industrial

Agua
Oxigeno
(si es
Energa
aerbic
o)

Los
m.o.
requier
Vitamin en
as Carbono

Element
os Nitrge
mineral no
es
Un medio de cultivo a grande escala, debe utilizar fuentes
de nutrientes baratos y presentar los siguientes criterios:

Producir el mximo rendimiento de producto o


biomasa por gramo de sustrato usado.

Producir la mxima concentracin de producto o


biomasa.

Permitir la mayor velocidad de formacin de


producto.

Habr un mnimo rendimiento de productos no


deseados.

Ser barato, de calidad consistente y disponible a lo


largo del ao.

Causar la menor cantidad de problemas en la


aeracin, agitacin, extraccin, purificacin.
Se debe recordar que
El medio seleccionado afectar el
diseo del fermentador usado.
El fermentador afecta la composicin
del medio.
Un medio con una alta viscosidad
requerir de una agitacin efectiva.
El medio puede ocasionar variacin
de pH, formacin de espuma,
potencial redox y en la morfologa del
organismo.
Medios de
crecimiento
Deben cumplir con los requerimientos:

Crecimiento
Formacin de productos
Suministrar energa para la sntesis de
metabolitos
Mantenimiento celular.
Macronutrientes, (g/L)
C, N, S, P, K y Mg

Micronutrientes o elementos trazas (mg/L o g/L))


Sales de Fe, Mn, Mo, Ca, Zn y Co

Factores de crecimiento
vitaminas, algunos aminocidos, cidos grasos no saturados,
etc.
Formulacin del Medio

Fuente de
Fuente Otros
Carbono y
energa de requerimient
Nitrge os
no

Clula Product CO H2O


bioma os
sa
Principles of Fermentation Technology. P.F. Stanbury and A. Whitaker. Pergamon Press, 1989
C, H, O,
N, S, P,
Mg, K

Element
os traza:
Factores de Fe, Zn,
crecimiento Cu, Mn,
ELEMENTO Co, Mo,
S B
NECESARI
OS

Agua Oxigeno

Principles of Fermentation Technology. P.F. Stanbury and A. Whitaker. Pergamon Press, 1989
Componentes elementales en BACTERIAS,
LEVADURAS, HONGOS
Elemento Bacterias Levaduras Hongos

Carbono 50-55 45-50 40-63


Hidrogeno 7 7
Nitrgeno 12-15 7.5-11 7-10
Fosforo 2.0-3.0 0.8-2.6 0.1-1.5
Sulfuro 0.2-1.0 0.01-0.24 0.1-0.5
Potasio 1.0-4.5 1.0-4.0 0.2-2.5
Sodio 0.5-1.0 0.01-0.1 0.02-0.5
Calcio 0.01-1.1 0.1-0.3 0.1-1.4
Magnesio 0.1-0.5 0.1-0.5 0.1-0.5
Cloruro 0.5 --- ---
Hierro 0.02-0.2 0.01-0.5 0.1-0.2

Principles of Fermentation Technology. P.F. Stanbury and A. Whitaker. Pergamon Press, 1989
Funcin de los componentes de algunos medios de
cultivo
Agua
Es el mayor componente en los medios de
fermentacin

Actividad de agua (Aw)


cantidad de agua disponible en el medio.
Aw 0.75 Halobacterium sp. y E. coli 0.96

pH y la cantidad de sales disueltas

La presencia de sulfato de calcio CaSO4 en el agua


favorece el sabor
amargo de la cerveza Pilsen
Fuentes de energa
La energa de crecimiento proviene de la
oxidacin de los componentes del medio o
de la luz

La mayor parte de las bacterias que se


emplean en la industria son quimiototrofas

Las fuentes ms comunes de energa sern


las fuentes de carbono, tales como
carbohidratos, lpidos y protenas.
Algunos microorganismos tambin
emplean metano o metanol como
fuentes de carbono y energa

Methanobacterium sp
Fuentes de carbono
Es comn en la prctica el uso de
carbohidratos como la fuente de carbono en
los procesos de fermentacin.

El hidrato de carbono ms ampliamente


disponible es el almidn de maz, tambin
es obtenido de cereales, papa y tapioca.

Algunas fuentes de almidn pueden ser


hidrolizadas para obtener glucosa.
Aceites vegetales comerciales (maz, soya,
olivo) se pueden incluir en el medio por dos
posibles razones

Pueden utilizarse como una fuente de


carbono principalmente como oleico, linolico
y cido oleico

Antiespumante en asociacin con un


tensoactivo
Existe un inters creciente en carbono que contiene
otros materiales.

Alcoholes, cidos orgnicos simples y alcanos.

stos compuestos se pueden obtener en una forma


pura, lo que simplificar la subsiguiente recuperacin y
de purificacin.
El metano, metanol y n-alcanos han sido utilizados como
sustratos para la produccin de biomasa.

El metanol es empleado como sustrato por Methylofilus


methylotrophus
Alcanos han sido utilizados en la produccin de cidos
orgnicos, aminocidos, vitaminas, cofactores, enzimas,
antibiticos y protenas
Factores que influyen en la
eleccin de fuentes de carbono

El principal producto de un proceso de fermentacin es el


que determina la eleccin de la fuente de carbono.

Por ejemplo en la obtencin de cidos ctricos se deben
eliminar iones metlicos que vienen como impurezas en
algunos hidratos de carbono.

La eleccin de la fuente tambin puede ser influenciado por


la legislacin gubernamental, en Escocia la produccin de
whisky slo se realiza con cebada de malta, agua y
levadura.
Reacciones de pardeamiento y formacin
de melanoidinas en la preparacin de
medios de cultivo afecta el crecimiento de
las bacterias.

Proceso de esterilizacin, el almidn se


gelatiniza al calentar, por lo que se utiliza
slo al 2%

La influencia de la fuente de
carbono en los productos de
formacin

El crecimiento rpido es debido al metabolizar


rpidamente altas concentraciones de azcar,
esto se asocia a menudo con la baja productividad
de metabolitos secundarios como antibiticos

El problema se resolvi con la adicin de un azcar


ligeramente difcil de metabolizar como lactosa
Fuentes de nitrgeno

El nitrgeno es utilizado para la biosntesis de


protenas, cidos nucleicos y polmeros de la
pared celular.
Fuentes inorgnicas

Sales de
amonio

Nitratos

Gas
amonio
Fuentes orgnicas

Aminocido
s

Protena

Urea
Factores que influyen en la eleccin
de las fuentes de Nitrgeno

Existen En mezclas de
mecanismos de fuentes de
control para la nitrgeno, los
nitrato reductasa, componentes
la cual se involucra individuales de
en la conversin de nitrgeno pueden
nitrato a ion influir en la
amonio regulacin del
metabolismo
Fermentaci
n
Mejores Fuentes de Nitrgeno para algunos Metabolitos Secundarios

Penicilina Licor de maceracin de Maz

Bacitracina Granos de Maz

Riboflavina Digerido Pancretico de Gelatina

Polienos Harina de Soya


Minerales
Adicionados Impurezas

Fosforo Cobalto
Potasio Cobre
Azufre Hierro
Calcio Manganeso
Cloro Molibdeno
Zinc
Intervalo tpico de concentracin
de componentes minerales
Componente Intervalo (g/dm 3

KH2PO4 1.0-4.0
MgSO47H2O 0.25-3.0
KCl 0.5-12.0
CaCO3 5.0-17.0
FeSO44H2O 0.01-0.1
ZnSO48H2O 0.1-1.0
MnSO4H2O 0.01-0.1
CuSO45H2O 0.003-0.01
Na2MoO42H2O 0.01-0.1
Vitaminas
Fuentes de carbono y nitrgeno
Vitamina pura
Reciclaje de nutrientes
Soluciones
Amortiguadoras
Compuesto especfico para
actuar como solucin
amortiguadora pH 7.0
Controlado por hidrxido de
sodio o amonio
Precursores

Ayuda a El precursor
Mejoramiento
regular la formara parte
en el
produccin de de la
rendimiento Licor de maz.
los estructura de
de la
microorganis producto
penicilina.
mos. obtenido.
Inhibidores

Es
eficaz
para
aument
ar el
rendimi
ento del Aument
product a la
o permea
desead bilidad
o. de la
pared
Producc celular.
in de
glicerol.
Producto Inhibidor Principal efecto Microorganismo

Glicerol Bisulfito de Disminucin en Saccharomyces


sodio la produccin cerevisiaea
de acetaldehdo

Tetraciclina Bromuro Baja formacin Streptomyces


de aureofaciens
Clortetraciclina

cido glutmico Penicilina Permeabilidad Micrococcus


de la pared glutamicus
celular
Inductores
Enzimas inducidas son
sintetizadas en respuesta a
la presencia del ambiente
del inductor.

Normalmente es el sustrato
o un compuesto
estructuralmente
relacionado.

Los carbohidratos
disminuyen el proceso
catablico.
Requerimientos de oxigeno

El oxgeno es un requerimiento
esencial en la produccin de
metabolitos y su control influye
mucho en la tasa de crecimiento
de microorganismos.
El medio puede influir en la
disponibilidad de oxgeno de las
siguientes maneras:

Metabolismo rpido
Reologa
Antiespumantes
Metabolismo Rpido

Diversos factores nutricionales


alteran la tenencia de oxgeno
Si la fuente de carbono es el
azcar se requerir una mayor
cantidad de oxgeno.
Se puede mejorar realizando
cambios en la formulacin del
medio
Reologa

Se puede modificar la viscosidad


en un medio de cultivo aadiendo
carbohidratos como almidn lo
cual produce un cambio reolgico
en el medio
Antiespumantes
La formacin de espuma es un
problema en la mayora de los
procesos metablicos

El uso de antiespumantes es lo mas


ideal para eliminar este problema.

Algunos espumantes son steres,


cidos grasos, siliconas y algunos
alcoholes
Mtodos para evaluar el
crecimiento microbiano
Mtodos
para evaluar
el
crecimiento
microbiano

Nmero de
Masa celular o
microorganis
biomasa
mos
Determinacin de la masa celular o biomasa

Peso seco

Directos
Peso hmedo

Determinacin de
nitrgeno total
Indirectos
Actividad metablica

Toledo R. Daniel. Determinacin del valor nutritivo y funcional de tres clones de Araz y seis de Boroj y
evaluacin para el proceso de obtencin de pulpas pasteurizadas y congeladas. [tesis Ingeniero Agroindustrial].
Ecuador, Escuela Politcnica Nacional, 2010.
Determinacin del nmero de
microorganismos
Cmara de
Neubauer
Cuenta total
microscpica
Cmara de Petrof

Directos
Vaciado en placa

Cuenta viable Extensin en placa

Nmero ms Tincin con azul de


probable tripano

Indirectos Turbidimetra

Nefelometra
Determinacin de azcares
reductores
Se basa en la reduccin de 3,5-
dinitrosaliclico a cido 3-amino-
5-nitrosaliclico por el grupo
carbonilo libre de los azcares
reductores.

Lectura 540 nm
Toledo R. Daniel. Determinacin del valor nutritivo y funcional de tres clones de Araz y seis de
Boroj y evaluacin para el proceso de obtencin de pulpas pasteurizadas y congeladas. [tesis
Ingeniero Agroindustrial]. Ecuador, Escuela Politcnica Nacional, 2010.
Densidad ptica (dispersin
de la luz)
Utilizadas para monitorear el
crecimiento de los cultivos bacterianos
Pueden llevar a resultados errneos.
Dan informacin sobre el peso seco
(contenido macromolecular).
La dispersin de la luz se puedemedir
por turbidimetra o por nefelometra.

Mancorda A, Cuadros D, lvarez A. Manual prctico de microbiologa ambiental 1. 2 ed. Buenos Aires:
Universidad Nacional del Comahue: 2007.
Turbidimetra
Mide la reduccin de la transmisin de luz
debido a partculas de una suspensin y
cuantifica la luz residual transmitida.
Se mide en un espectofotmetro UV/Vis.
El cambio de luz se mide en %T
Tambin se determina como Absorbancia
(densidad ptica), utilizada para graficar el
crecimiento bacteriano.

Tortora GJ, Funke GR, Case Cl. Introduccin a la Microbiologa. 9 ed. Buenos Aires: Mdica
Panamericana; 2007.
Peso seco
Ventajas:

Se puede conocer el
nmero de MO
dividiendo el peso del
cultivo/ peso seco de la
clula individual.

Desventajas:

Se necesita un mnimo
de 25 mL de cultivo
relativamente denso.
Los componentes
voltiles de la muestra
pueden perderse.
La muestra puede
Procedimiento

105
Peso hmedo
METODOLOGA
MEDIOS DE CULTIVO
MEDIO SEMILLA MEDIO DE PRODUCCIN
Glucosa Glucosa
40g 40 g
Fosfato dibsico de potasio Fosfato dibsico de potasio 10
10 g g
Fosfato monobsico de Fosfato monobsico de
potasio
potasio
10 g
10 g
Fuente de nitrgeno* 10 g
Peptona de casena Agua de la llave
10 g 1L
Sulfato de amonio Ajuste el pH a 5.5
15g *Fuente de Nitrgeno
Agua de la llave 1. Sulfato de amonio
2. Extracto de malta
1L
3. Extracto de levadura
Ajuste el pH a 5.5 4. Peptona de casena
5. Urea
6. Nitrato de sodio
PROPAGACIN
Incubar en
Inocular matraz
Tomar asadas de agitacin de 200
con medio
Candida utilis r.p.m a 28C por
semilla
24 hs.

Preparar 100 mL
Incubar con Inocular con 1
de medio de
agitacin de 200 mL de cultivo
produccin para
r.p.m. y 28C con medio
cada fuente de
durante 96 hs. semilla
nitrgeno

Tomar muestra
de 10 mL con Colocar en tubos
pipetas estriles con tapa de
Agitar el matraz a las 0, 24, 48, rosca y
72, 96 hs de guardarlas en
incubacin congelacin
DETERMINACIN DE DENSIDAD
PTICA Y PESO SECO
Separar
Tomar 5 mL de sobrenadante y
Colocar en tubo Centrifugar 5
cultivo de cada guardar para
de ensayo min a 3000 r.p.m.
muestra DNS

Transferir la Determinar
Centrifugar suspensin a densidad ptica a Agregar 5 mL de
mismas tubo de ensaye 540 nm con solucin salina
condiciones llevado a peso blanco de agua para resuspender
cte destilada

Desechar Llevar paquete


sobrenadante celular a peso
cte. a 70C
DETERMINACIN DE PESO HMEDO

Tomar 1 mL de cultivo de cada muestra

Colocar en tubo de ensaye previamente pesado

Centrifugar 5 min a 3000 r.p.m.

Retirar sobrenadante

Pesar tubo con sedimento

Registrar peso de masa celular


DETERMINACIN DE
AZCARES REDUCTORES POR
EL MTODO DNS
Preparar el DNS
Colocar en tubo Agregar 1 mL de
por lo menos 24
de ensayo 1 mL DNS y
horas antes de
de sobrenadante homogeneizar
utilizarse

Llevar mezcla a
Agregar 8 mL de Inmediatamente bao de agua a
agua destilada poner en agua fra ebullicin durante
5 min.

Determinar
Realizar lo mismo
densidad ptica a
para cada
575 nm con agua
solucin de la
destilada como
curva de glucosa
blanco
Curva estndar de DNS
Solucin estndar de glucosa 1 g/L

No tubo mL de solucin mL de agua Concentracin


estndar destilada mg/mL

1 0.0 1.0 0
2 0.2 0.8 200
3 0.4 0.6 400
4 0.6 0.4 600
5 0.8 0.2 800
6 1,.0 0.0 1000
Referencias
Principles of Fermentation Technology. P.F. Stanbury and A.
Whitaker. Pergamon Press, 1989
Toledo R. Daniel. Determinacin del valor nutritivo y
funcional de tres clones de Araz y seis de Boroj y
evaluacin para el proceso de obtencin de pulpas
pasteurizadas y congeladas. [tesis Ingeniero Agroindustrial].
Ecuador, Escuela Politcnica Nacional, 2010.
Mancorda A, Cuadros D, lvarez A. Manual prctico de
microbiologa ambiental 1. 2 ed. Buenos Aires: Universidad
Nacional del Comahue: 2007.
Tortora GJ, Funke GR, Case Cl. Introduccin a la
Microbiologa. 9 ed. Buenos Aires: Mdica Panamericana;
2007.