Tema 5

Plsmidos
Su existencia en la Naturaleza. Importancia
en la Transferencia Horizontal de genes en
comunidades microbianas. Ocurrencia y
abundancia en arqueas, levaduras y
bacterias. Ventajas adaptativas.
Tipos: Circulares y Lineales. Modos de
replicacin.
 Se conocen tres mecanismos generales por
los que las bacterias pueden transferir
lateralmente informacin gentica:

conjugacin,
transformacin
y transduccin
 Estos mecanismos sexuales, o mas bien
parasexuales, difieren en muchos aspectos de los
mecanismos sexuales de los eucariontes:

Son unidireccionales, de un donador a un receptor;

se transfiere solo una fraccin del genoma, que
puede involucrar desde algunos pares de bases a
cientos de kilobases, dependiendo principalmente
del mecanismo de transferencia;
 La transferencia de genes ecolgicamente
adaptativos permite la diversificacin y
especiacin bacteriana,

Por lo que estos eventos tienen un gran impacto

sobre la evolucin de las poblaciones de estos
organismos.
 Esta es una de las grandes diferencias y ventajas
del intercambio gentico en bacterias con
respecto al de los eucariontes; las bacterias no
tienen que reinventar la rueda:

La transferencia de genes, operones e islas

genmicas crean nuevos linajes con
combinaciones nicas que pueden explotar
nuevos nichos y generar nuevas especies o
ecotipos a travs de uno o unos pocos eventos
evolutivos
 La transferencia horizontal de genes (HGT, por
sus siglas en ingls) consiste en la transmisin del
genoma o parte de ste de un organismo a otro
que no forma parte de su descendencia.

Por el contrario, el tipo de transferencia habitual,

o transferencia vertical de genes, es la que se da
desde un ancestro a su descendencia, como ocurre
por ejemplo en la reproduccin sexual.
 Desde hace tiempo se conoce la importancia del
proceso de HGT en procariotas, como en el caso
de la conjugacin bacteriana, con la mediacin de
plsmidos.

Estos procesos son muy importantes como fuente

de variacin gentica, equivalentes en cierto
modo a la recombinacin cromosmica de los
organismos con reproduccin sexual.
 Sin embargo, la HGT en bacterias va ms all, dado
que tambin se produce transferencia gentica entre
especies alejadas filogenticamente,

Lo cual permite la formacin de genomas

extraordinariamente heterogneos y dinmicos.
 Qu es un Plsmido?
El plsmido es una molcula circular de DNA que
tiene una existencia independiente en la clula.

Los plsmidos son muy abundantes en las bacterias,

y mas escasos en las clulas eukariotas.

Llevan en su seno varios genes, a menudo

responsables de caractersticas tiles para la clula.
 Por ejemplo, la capacidad para soportar
concentraciones txicas de un antibitico, como
el cloranfenicol o la ampicilina.
 Son elementos genticos que se replican
independientemente del cromosoma.

Se encuentran dentro de la clula.

Existen varios tipos de plsmidos.

En E. coli, se han aislado mas de 300

 Estos genes se emplean para seleccionar aquellas
clulas que tienen un plsmido de las que no lo
tienen.

La mayora de los plsmidos tienen una

secuencia que sirve como orgen de replicacin.
Esto le permite replicarse independientemente.

Los plsmidos mas pequeos emplean la

maquinaria celular para su duplicacin y
mantenimiento.
 Otros son capaces de integrarse en el cromosoma
principal durante generaciones (episomas).
Luego se pueden volver a escindir.
 Estn presentes normalmente en bacterias, y en
algunas ocasiones en organismos eucariotas como
las levaduras.

Su tamao vara desde 1 a 250 kb.

El nmero de plsmidos puede variar, dependiendo

de su tipo, desde una sola copia hasta algunos
cientos por clula
 Tamao y nmero de copia
El tamao de un plsmido es variable. (1 kb-250kb).

Como vector, es deseable que su tamao no sobrepase

10kb.
Ejemplos:
PUC8 2,1kb E. coli
ColE1 6,4kb E. coli
F 95 kb E. coli
 Tamao
Existe una amplia gama: hasta plsmidos muy
grandes (ciertos plsmidos de Pseudomonas
tienen 500 kb).

Incluso existen megaplsmidos en ciertos

Rhizobium que llegan a tener 1600 kb.
 Caractersticas de los
Plsmidos
Replicacin autnoma
Estabilidad
Incompatibilidad
Transferencia:
Plsmidos conjugativos
Plsmidos no conjugativos
Integracin (Episomas)
Confieren distintas propiedades fenotpicas
 Tipos de plsmidos

P. conjugativos: codifican pili sexuales y protenas

necesarias para la transferencia de DNA.

P. R (resistencia a los antibiticos, mercurio).

P. Produccin de bacteriocinas y antibiticos.

 FENOTIPOS Y FUNCIONES
DETERMINADOS POR
PLSMIDOS
Plsmidos de virulencia: produccin de toxinas,
factores de penetracin en tejidos, adherencia a
tejidos del hospedador, etc., en ciertas bacterias
patgenas.
.
 Plsmidos de virulencia: produccin de toxinas,
enzimas, tumores. (E. coli O157 Toxina shiga)

Plsmidos de funciones fisiolgicas:

Utilizacin de urea,
Fermentacin de carbohidratos.
Produccin de pigmentos.
 Produccin de siderforos (quelatos para
secuestrar iones Fe3+).
 Utilizacin de hidrocarburos, incluyendo algunos
cclicos recalcitrantes (degradacin de tolueno,
xileno, alcanfor, etc.) en Pseudomonas.

Induccin de tumores en plantas (plsmido Ti de

Agrobacterium tumefaciens).

Interacciones simbiticas y fijacin de nitrgeno en

ciertos Rhizobium
 Nmero de copias
Cada tipo de plsmido tiene un nmero medio de
copias por clula caracterstico.
Por regla general, los grandes plsmidos tienen una
o dos copias por clula (plsmidos con control
estricto de la replicacin).
Mientras que los pequeos suelen estar presentes
como varias copias (>10), denominndose
plsmidos de control relajado.
 E coli, posee un plsmido conjugativo llamado
Factor F:
- Capacidad para sintetizar pili.
- Movilizacin del DNA para su transferencia.
- Alteracin de receptores de la superficie de la
clula.
 Conjugacin
Los plsmidos se pueden clasificar en dos grupos:
conjugativos y no conjugativos.

Los conjugativos tienen la capacidad de promover la

conjugacin.

El plsmido F de E. coli es capaz de integrarse en el

cromosoma.

Cuando la conjugacin tiene lugar en esta situacin, parte

del cromosoma se transfiere a la cepa F-.
 Solo los plsmidos conjugativos tienen la
capacidad de ser transferidos en la conjugacin.

A veces, en presencia de un plsmido conjugativo,

otro plsmido puede transferirse.

A este mecanismo de conjugacin se debe el

surgimiento de la resistencia bacteriana a los
antibiticos
Conjugacin en Gram negativos
 Conjugacin en Gramnegativos

1. Formacin de
pares efectivos
2. Transferencia
de ADN F+ F- F+ F-

Origen de
transferencia
Replicacin
cadenas ADN F+ F+ F+ F+
 Conjugacin: Importancia

Bacterias Gram -
Resistencia antimicrobianos
Diseminacin rpida
Bacterias Gram +
Produccin de factores de adherencia
Resistencia antimicrobianos
 Compatibilidad
Plsmidos distintos pueden encontrarse en una
misma clula.

En E. coli se han descrito hasta siete tipos

distintos coexistiendo en una clula.

Sin embargo, para ello, tienen que ser

compatibles.
 Algunos plsmidos se pierden rpidamente en
presencia de otros, y por tanto, hay una serie de
grupos de incompatibilidad.

Las bases de la incompatibilidad no se entienden

bien, pero parecen tener que ver con la replicacin.
 INCOMPATIBILIDAD ENTRE
PLSMIDOS Y GRUPOS DE
INCOMPATIBILIDAD
Cada plsmido, dentro de la amplia diversidad de los que
se conocen, se suele clasificar segn el grupo de
incompatibilidad al que pertenece.

Los grupos de incompatibilidad se suelen denominar con

las siglas Inc seguidas de una letra mayscula (por
ejemplo IncP, IncFII, etc).
 REPLICACIN
Modelo de replicacin en (theta):

Separacin de las dos cadenas en el sitio oriV, creando una

estructura que se parece a la letra griega (theta).

La replicacin es unidireccional (slo hay una horquilla de

replicacin , que avanza a lo largo de la molcula, hasta que vuelve
al sitio oriV, en el que las dos molculas hijas se separan).
 Otros plsmidos se replican en por un modelo bidireccional (dos
horquillas de replicacin de sentidos opuestos, que se encuentran
cerca de la mitad de la molcula).

La replicacin en es frecuente en plsmidos de bacterias Gram-

negativas.
 Modelo de replicacin en (sigma), o
modelo del crculo rodante
Una de las dos cadenas es rota a nivel de oriV, de modo
que el extremo 3 suministra el cebador para la replicacin
de la cadena adelantada.

La cadena desplazada (cadena menos) funciona como

cadena retrasada (lagging) y debe ser replicada a partir
de sitios de cebado especiales.
Este tipo de replicacin es frecuente en plsmidos de
bacterias Gram-positivas.
El mismo tipo de sistema de control
del nmero de copias y de reparto
El nmero total de copias nA+nB = N (determinado por
el sistema de control) no vara,

Pero por fluctuaciones aleatorias en el reparto, algunas

clulas heredan ms copias de uno de los plsmidos que
del otro, y tras varias generaciones aparecen clulas
carentes de uno o del otro plsmido (nA = 0 y nB = N, o
viceversa).
 Cada plsmido contiene al menos una secuencia de
ADN que sirve como un origen de replicacin u
ORI (un punto inicial para la replicacin del
ADN),

Lo cual habilita al ADN para ser duplicado

independientemente del ADN cromosomal.
 Los plsmidos de la mayora de las bacterias son
circulares, pero tambin se conocen algunos
lineales, los cuales reensamblan superficialmente
los cromosomas de la mayora de eucariotes.
 Vectores de clonado
Plsmidos, fago Lambda, csmidos, y
cromosoma artificial de levadura (YAC).
 Un tpico vector de clonado (Modelo de
clonado)

Contiene un sitio de policlonado( polilinker),

Un gen de resistencia a Ampicilina (ampr) como

marcador

Y un origen de replicacin (ORI).

 Utilizando un plsmido se inserta y liga un
fragmento con un gen de inters.

Capacidad de almacenaje: hasta 25 Kb.

 Los plsmidos se utilizan en ingeniera
gentica como vectores de clonado por la
facilidad con la que se manipulan.
 Un vector plasmdico se fabrica a partir de
plsmidos naturales cuyos segmentos
innecesarios son eliminados, agregndose en
cambio secuencias esenciales
 Para clonar una muestra de la ADN, se debe
utilizar la misma enzima de restriccin para cortar
el vector y la muestra de ADN.

Por lo tanto, un vector contiene generalmente una

secuencia (polylinker) que pueda reconocer varias
enzimas de restriccin para poder utilizar el vector
para clonar diversos fragmentos de ADN.
Caractersticas generales de los vectores de expresin:

- promotor
- terminador
- sitio de unin a ribosoma
- sitios nico de corte de enzimas
- marcadores genticos
- orgen de replicacin
- tamao pequeo
 Vectores basados en plsmidos
pBR322
Nomenclatura: pBR322.
Tamao: 4363pb. Capacidad: hasta 10.000
Contiene dos marcadores de resistencia:
Amp y Tet.
Es un plsmido multicopia. Pueden
encontrarse hasta 15 copias por clula.
Utilizando cloranfenicol, puede aumentarse
hasta 1000-3000.
El mapa de pBR322
 pUC18: un plsmido avanzado
Desciende de pUC8, a su vez de pBR322.
Conserva el origen de replicacin y ampR.
La secuencia del marcador se ha alterado para
eliminar los sitios de restriccin.
Estos se encuentran insertos en la secuencia de
lacZ.
Ventajas: 500-700 copias/clula. Identificacin
directa empleando X-gal. Mltiples sitios para
clonar (sitios de restriccin).
Mapa de restriccin de pUC18
El plsmido pGEM3
 Vectores basados en M13
El genoma de M13 consiste de 6,4Kb, de los que
la mayora corresponde a 10 genes
empaquetados.Todos son esenciales.
Queda una regin intergenica de 507 nucletidos
que tiene el origen de replicacin: ori.
A pesar de estas dificultades, el hecho de que este
vector se encuentra en forma monocatenaria lo
hace muy atractivo para procesos de clonaje.
 Estrategias para desarrollar vectores
basados en M13
Los vectores MP13mp contienen el gen LacZ.
Los ms modernos (mp7) tienen insertado un polilinker
simtrico.
O en su caso, polilinkers que permiten incorporar
fragmentos con extremos cohesivos distintos,
asegurando la orientacin de la insercin (mp8/9).
Existen otros vectores mixtos con plsmidos: phagemids
o fagmidos.
CLONACIN MOLECULAR
Aislamiento e incorporacin de un
fragmento de DNA dentro de
un vector en el que puede
replicarse

Aislamiento del gen de inters

Insercin en un vector de clonacin

Transformacin de la clula husped

Purificacin y anlisis del ADNc

Expresin del ADNc y anlisis de la protena

 Seleccin de recombinantes empleando la
tcnica de la a complementacin

X-galactosa incorporado en la placa de cultivo permite la

seleccin de las colonias que han incorporado el plsmido
con el inserto:
- Colonias con inserto
Se inactiva el gen LacZ, no hay a complementacin
Se observan colonias blancas

-Colonias sin inserto

No se inactiva el gen LacZ, hay a complementacin
Se observan colonias azules
Que representan las colonias blancas?
Que representan las colonias azules?
Que colonias utilizara?
Si nos olvidamos de colocar ATB en la placa que resultado
obtendriamos?
Qu pas???????????????
Tres formas de plsmidos en los
geles
Bibliotecas genticas o genotecas
Son colecciones de vectores que colectivamente
contienen todos los fragmentos de un organismo.
Cuantos clones hacen falta para albergar un
genoma?
N= ln(1-P)/ln(1-a/b)
P= la probabilidad de que un gen est presente, a
es el tamao medio de fragmento y b es el tamao
total del genoma.
 Valores de N: Tabla por especies

Especie Genoma (pb) n clones

de 17kb de 35kb
E.coli 4 x 106 820 410
S. cerevisiae 1.8 x 107 3225 1500
Arroz 5.7 x 108 100000 49000
Humanos 3.2 x 109 564000 274000
ARCHAEA

BACTERIA
 Caractersticas:
Tienen una pared celular que brinda proteccin a los
procariotas y les confiere su forma caracterstica.
Algunos procariotas se desplazan mediante flagelos
simples.
Las endosporas protectoras permiten a ciertas
bacterias soportar condiciones adversas.
Se reproducen por fisin binaria
 Se especializan en hbitats especficos y
presentan diversos metabolismos.
Desempean muchas funciones que son
importantes para otras formas de vida.
Algunas bacterias constituyen una amenaza para
la salud humana.
 BACTERIA y ARCHAEA
Diferencias
La rgida pared celular que encierra las clulas bacterianas contiene
peptidoglicano, pero las paredes celulares de las arqueas carecen de
esta sustancia exclusivamente bacteriana y poseen
pseudopeptidoglicano, glicoprotenas o protena dispuesta en simetra
hexagonal (capa superficial paracristalina-Capa S)

La estructura y composicin de otros componentes celulares como las

membranas plasmticas, los ribosomas y las ARN polimerasas.

Las caractersticas fundamentales de procesos bsicos como la

transcripcin y la traduccin.
 El grupo ms antiguo, las arqueobacterias, constituyen
un fascinante conjunto de organismos y por sus
especiales caractersticas se considera que conforman un
Dominio separado: Archaea.

Fenotpicamente, Archaea son muy parecidos a las

Bacterias. La mayora son pequeos (0.5-5 micras) y con
formas de bastones, cocos y espirilos.

Las Archaea generalmente se reproducen por fisin,

como la mayora de las Bacterias.

Los genomas de Archaea son de un tamao sobre 2-4

Mbp, similar a la mayora de las Bacterias.
 Si bien lucen como bacterias poseen caractersticas
bioqumicas y genticas que las alejan de ellas.

Por ejemplo: no poseen paredes celulares con

peptidoglicanos
Presentan secuencias nicas en la unidad pequea
del ARNr

Poseen lpidos de membrana diferentes tanto de las

bacterias como de los eucariotas (incluyendo
enlaces ter en lugar de enlaces ster)
 Las arqueas existen en una gran variedad de
hbitats, son una parte importante de los
ecosistemas globales

Cuatro grupos fisiolgicos principales. Son los

halfilos,
termfilos,
alcalfilos
y acidfilos
 Las arqueas, por lo general, tienen un nico
cromosoma circular al igual que las bacterias, que
vara en tamao desde 5.751.492 pares de bases
en Methanosarcina acetivorans,

El mayor genoma secuenciado hasta la fecha,

hasta 490.885 pares de bases en Nanoarchaeum
equitans, el genoma ms pequeo conocido que
puede contener slo 537 genes codificadores de
protenas.
 Las arqueas tambin pueden presentar plsmidos
que se pueden propagar por contacto fsico entre
clulas, en un proceso que puede ser similar a la
conjugacin bacteriana.

Los plsmidos son cada vez ms importantes como

herramientas genticas pues permiten la realizacin
de estudios genticos en Archaea
 Qu es una levadura?
Dominio:Eukaria
Reino:Fungi
Principales
Caractersticas: Hetertrofos
Unicelulares
Pared celular de quitina
Reproduccin por gemacin
Metabolismo respiratorio (aerbico) y fermentativo
 El genoma de levadura contiene un conjunto de
16 cromosomas completamente caracterizados.

Sus tamaos oscilan desde 200 a 2.200 kb.

Se calcula que aprox. debe contener unos 6200

marcos abiertos de lectura, o genes.
 Plasmidos en levadura
Se conocen plsmidos en eucariotas.

Los ms conocidos son el plsmido de 2 micras

en levaduras y los plsmidos que transmiten
androesterilidad en el maz, llamados S1 y S2
presentes en las mitocondrias.
El gran inters que despertaron estas partculas
fue principalmente por su propiedad para
transmitir la resistencia a los antibiticos y a
sustancias txicas
 Plasmidos en levadura
Ciertos vectores (YEP o Yeast episomal plasmids)
contienen el origen de replicacin de un plsmido natural de
S. cerevisiae, el plsmido 2 (mu, letra griega).

Tal vector se mantiene en forma de epsomos en nmero de

10 a 40 copias por clula (integrado al cromosoma).

Los plsmidos que contienen las secuencias 2 son

relativamente estables en la levadura, son transmitidos
eficientemente a la descendencia durante la mitosis.
 Plasmidos en levadura

Los vectores pESC constituyen una serie de vectores

eptopes marcados diseados para la expresin y el anlisis
funcional de genes eucariotas en la levadura S. cerevisiae.

Estos vectores contiene los promotores GAL1 y GAL10 de

levadura.
 Plasmidos en levadura

YCP ou Yeast centromere plasmids:

Otros vectores (YCP o Yeast centromere plasmids)

contienen un orgen de replicacin cromosmico
ARSH4 (Autonomous replicating sequence), secuencia
de replicacin autnoma y un centrmero CEN6 : ellos
estn presente en nmero de 1 a 2 copias por clula .

.
 Plasmidos en levadura
Los vectores pYC
Contienen el orgen de replicacin para un nmero
pequeo de copias CEN6/ARSH4 en levadura.

Se encuentran disponibles con una variedad de

marcadores de seleccin.

A los vectores pYC tambin se los encuentra con una

variedad de eptope tags (marcadores epitopes) para la
deteccin y purificacin de protenas recombinadas.
 Plasmidos en levadura
El vector pYC2/NT contiene un N-terminal Xpress-
6xHis tag,

Mientras que los vectores pYC2/CT y pYC6/CT

contienen un C-terminal V5-His tag.

Tanto el vector pYC2/NT como el pYC2/CT poseen el

gen marcador URA3 para su seleccin.

El vector pYC6/CT contiene el gen de resistencia al

Blasticidina para su seleccin en levadura.
 Vectores de levaduras

Tipos de vectores
YIp: integrativos: una copia integrada al cromosoma

YEp: episomales: ori 2m (alto nmero de copias)

YCp: centromricos: ARS, CEN (1 o 2 copias por cl)

Promotores

Promoter Status

Acid phosphatase PHO5 Inducible

Alcohol dehydrogenase I ADH I Constitutive
Alcohol dehydrogenase II ADH II Inducible
Galctokinase GAL 1 Inducible
Metallothionein Cup 1 Inducible
Phosphoglycerate kinase PGK Constitutive
Triose Phosphate isomerase TPI Constitutive

21-Expresin protenas-BM 2009

Vectores episomales Vectores centromricos

22-Expresin protenas-BM 2009

23-Expresin protenas-BM 2009
 Expresin de protenas en Pichia pastoris
1) Requiere tcnicas simples para la manipulacin gentica (similar a S. cerevisiae)
2) Produccin de altos niveles de protenas (intra y extracelular)
3) Modificaciones post-traduccionales: glicosilacin, puente disulfuro, procesamiento
proteoltico.
4) Kits de expresin disponibles.
5) Empleo del gen AOX1

Ampr, oriE: mantenimiento en E. coli

AOX1p: promotor de alcohol oxidasa.
AOX1t: secuencias terminador transcripcin.
MCS: sitio mltiple clonado.
HIS4: marcador biosinttico.
3-AOX1

MCS
Diagrama general de un vector P pastoris shuttle
24-Expresin protenas-BM 2009
 Integracin del vector de P. pastoris
Se integran para maximizar la estabilidad del sistema de expresin.
Corte del vector que lleva inserto de inters flanqueado por secuencias del gen AOX1 (para recombinacin
homloga requiere regiones terminales mas largas que S cerevisiae.)
Transformacin con vector linealizado por electroporacin o mtodos qumicos.
Cepa husped: his4 pep4 prb1 (auxotrfica para Histidina y deficiente en proteasas).

Inserto

Inserto

Seleccin en medio his-

Cepa resultante aox1=Muts
Metanol: crec lento, alta produccin prot. 25-Expresin protenas-BM 2009
Pichia methanolica Expression System

Expresin controlada por promotor AUG1 (alcohol

oxidasa):
reprimido por glicerol o glucosa
Inducido por metanol
a-factor: pptido seal para secrecin de la
protena expresada.
V5 eptope: para deteccin con anticuerpos anti-V5
6xHis: tag polihistidina purificacin nquel-agarosa.
ADE2: marcador biosinttico.

26-Expresin protenas-BM 2009

MUCHAS GRACIAS