Enzyme Linked Immunosorbent Assay

(ELISA)
Eiomitta Rizki Amanda, S.Si., M.Sc.
What is ELISA:
EL (Enzyme-linked): Aktivitas enzim sebagai pelapor dari suatu tes yang
menggambarkan keberadaan/jumlah immunosorbent. Adanya reaksi
enzimatik akan menghasilkan spesi yang berwarna.
IS (Immunosorbent): antibodi atau antigen (immuno) diadsorbsi
(sorbent) pada sumur polistirena (well plate) dimana kita melakukan
pengujian.
A (Assay): Analisis kadar secara kuantitatif
ELISA: Analisis interaksi antigen dengan antibody di dalam suatu sampel
dengan menggunakan enzim sebagai pelapor.
Prinsip Analisis Menggunakan ELISA
Pertama antigen atau antibodi yang hendak diuji ditempelkan pada
suatu permukaan yang berupa microtiter. Penempelan tersebut dapat
dilakukan melalui dua cara, yaitu penempelan secara non spesifik
dengan adsorbs ke permukaan microtiter, dan penempelan secara
spesifik dengan menggunakan antibody atau antigen lain yang bersifat
spesifik dengan antigen atau antibodi yang diuji (cara ini digunakan
pada teknik ELISA sandwich).
Selanjutnya antibodi atau antigen spesifik yang telah ditautkan dengan
suatu enzim signal (disesuaikan dengan sampel => bila sampel berupa
antigen, maka digunakan antibodi spesifik , sedangkan bila sampel
berupa antibodi, maka digunakan antigen spesifik) dicampurkan ke atas
permukaan tersebut, sehingga dapat terjadi interaksi antara antibodi
dengan antigen yang bersesuaian.
lanjutan
Kemudian ke atas permukaan tersebut dicampurkan suatau substrat
yang dapat bereaksi dengan enzim signal. Pada saat substrat tersebut
dicampurkan ke permukaan, enzim yang bertaut dengan antibodi atau
antigen spesifik yang berinteraksi dengan antibodi atau antigen sampel
akan bereaksi dengan substrat dan menimbulkan suatu signal yang
dapat dideteksi.
Ringkasan Prinsip Analisis Menggunakan ELISA
Sejumlah antigen/antibodi yang tidak dikenal ditempelkan pada pada
suatu permukaan yang mengandung antibodi/antigen. Antibodi/antigen
ini telah terikat oleh suatu enzim dan pada tahap akhir ditambahkan
substansi yang dapat diubah oleh enzim menjadi sinyal yang dapat
dideteksi. Contoh: Dalam ELISA fluoresensi, saat cahaya dengan
panjang gelombang tertentu disinarkan pada suatu sampel, kompleks
antigen/antibodi akan berfluoresensi sehingga jumlah antigen pada
sampel dapat disimpulkan berdasarkan besarnya fluoresensi
Jenis-jenis Elisa berdasarkan prinsip
analisisnya:
1. Direct ELISA

2. Indirect ELISA

3. Sandwich ELISA

4. Competitive ELISA
 Direct ELISA
Teknik ini seringkali digunakan untuk mendeteksi dan mengukur konsentrasi
antigen pada sampel ELISA direct menggunakan suatu antibody spesifik
(monoklonal) untuk mendetaksi keberadaan antigen yang diinginkan pada
sampel yang diuji.
microtiter diisi dengan sampel yang mengandung antigen yang diinginkan
antigen tersebut dapat menempel pada bagian dinding-dinding lubang microtiter,
kemudian microtiter dibilas untuk membuang antigen yang tidak menempel pda
dinding lubang microtiter
antibodi yang telah ditautkan dengan enzim signal dimasukkan ke dalam lubang-
lubang microtiter sehingga dapat berinteraksi dengan antigen yang diinginkan
ke dalam lubang-lubang microtiter tersebut ditambahkan substrat yang dapat
bereaksi dengan enzim signal, sehingga enzim yang tertaut dengan antibodi yang
telah berinteraksi dengan antigen yang diinginkan akan berinteraksi dengan
substrat dan menimbulkan signal dapat dideteksi.
 Kelebihan dan Kelemahan Direct ELISA
ELISA direct memiliki beberapa kelemahan, antara lain :
a. Immunoreaktifitas antibodi kemungkinan akan berkurang akibat bertaut dengan
enzim.
b. Penautan enzim signal ke setiap antibodi menghabiskan waktu dan mahal.
c. Tidak memiliki fleksibilitas dalam pemilihan tautan enzim (label) dari antibodi
pada percobaan yang berbeda.
d. Amplifikasi signal hanya sedikit.
e. Larutan yang mengandung antigen yang diinginkan harus dimurnikan sebelum
digunakan untuk uji ELISA direct.
Sedangkan kelebihan dari ELISA direct antara lain :
a. Metodologi yang cepat karena hanya menggunakan 1 jenis antibody.
b. Kemungkinan terjadinya kegagalan dalam uji ELISA akibat reaksi silang dengan
antibody lain (antibody sekunder) dapat diminimalisasi.
 Indirect ELISA
Pada teknik ELISA indirect yang dideteksi dan diukur konsentrasinya merupakan
antibody
ELISA indirect menggunakan suatu antigen spesifik (monoklonal) serta antibody
sekunder spesifik tertaut enzim signal untuk mendeteksi keberadaan antibody yang
diinginkan pada sampel yang diuji.
antigen yang diuji dimasukkan dalam plate
Plate dicuci, dan antibodi pendeteksi yang spesifik untuk antigen yang diuji
dimasukkan dalam lubang.
Antibodi sekunder, yang akan mengikat sembarang antibodi pendeteksi,
ditambahkan dalam lubang. Antibodi sekunder ini akan berkonjugasi menjadi enzim
dengan substrat spesifik. Tahap ini bisa dilewati jika antibodi pendeteksi berkonjugasi
dengan enzim.
Dimasukkan substrat yang akan diubah oleh enzim untuk mendapatkan sinyal
kromogenik/ fluorogenik/ elektrokimia.
Hasil dikuantifikasi dengan spektrofotometer, spektrofluorometer atau alat optik/
elektrokimia lainnya
Kelebihan dan Kekurangan Indirect ELISA
ELISA indirect memiliki beberapa kelemahan, antara lain :
a. Membutuhkan waktu pengujian yang relative lebih lama daripada ELISA
direct karena ELISA indirect membutuhkan 2 kali waktu inkubasi yaitu pada
saat terjadi interaksi antara antigen spesifik dengan antibody yang dinginkan
dan antara antibody yang diinginkan dengan antibody sekunder tertaut enzim
signal, sedangkan pada ELISA direct hanya membutuhkan 1 kali waktu
inkubasi yaitu pada saat terjadi interaksi antara antigen yang diinginkan dengan
antibody spesifik tertaut enzim signal.
Sedangkan kelebihan dari ELISA indirect antara lain :
a. Terdapat berbagai macam variasi antibody sekunder yang terjual secara
komersial di pasar.
b. Immunoreaktifitas dari antibody yang diinginkan (target) tidak terpengaruh
oleh penautan enzim signal ke antibody sekunder karena penautan dilakuka
pada wadah berbeda.
c. Tingkat sensitivitas meningkat karena setiap antibody yag diinginkan
memiliki beberapa epitop yang bisa berinteraksi dengan antibody sekunder.
 Sandwich ELISA
Jenis ELISA yang dapat digunakan untuk mengukur antigen maupun antibody
Menggunakan antibody penangkap atau primer spesifik untuk menangkap antigen
yang diinginkan
antibody sekunder tertaut enzim signal untuk mendeteksi keberadaan antigen yang
diinginkan
Antigen yang akan diukur konsentrasinya berikatan terlebih dahulu dengan antibody
penangkap
Antigen yang telah berikatan dengan antibody penangkap akan berikatan kembali
dengan antibodi sekunder tertaut enzyme
antibody primer seringkali disebut sebagai antibody penangkap, sedagkan antibody
sekunder seringkali disebut sebagai antibody deteksi.
Dalam pengaplikasiannya, ELISA sandwich lebih banyak dimanfaatkan untuk
mendeteksi keberadaan antigen multivalent yang kadarnya sangat rendah pada suatu
larutan dengan tingkat kontaminasi tinggi.
Faktor yang mempengaruhi Sandwich ELISA
Banyaknya molekul antibody penangkap yang berhasil menempel pada
dinding-dinding microtiter.
Avinitas dari antibody penangkap dan antibody detector terhadap
antigen sebenarnya, teknik ELISA sandwich ini merupakan
pengembangan dari teknik ELISA terdahulu, yaitu ELISA direct.
Kelebihan dan Kekurangan Sandwich ELISA
Kelebihan:
eknik ELISA sandwich ini pada dasarnya berada pada tingkat
sensitivitasnya yang relatif lebih tinggi karena antigen yang diinginkan
harus dapat berinteraksi dengan dua jenis antibody, yaitu antibody
penangkap dan antibody detector
kemampuannya menguji sampel yang tidak murni, dan mampu
mengikat secara selektif antigen yang dikehendaki
Tanpa lapisan pertama antibodi penangkap, semua jenis protein pada
sampel (termasuk protein serum) dapat diserap secara kompetitif oleh
permukaan lempeng, menurunkan kuantitas antigen yang terimobilisasi.
Kekurangan:
teknik ini hanya dapat diaplikasikan untuk medeteksi antigen yang
bersifat multivalent
ulitnya mencari dua jenis antibody yang dapat berinteraksi antigen yang
sama pada sisi antigenic yang berbeda (epitopnya harus berbeda)
Competitif ELISA
Digunakan untuk mengukur konsentrasi antigen atau antibody
Sampel yang mengandung Antibodi dan antibodi tertaut enzim yang
akan diukur diinkubasi
Sampel yang mengandung Antibodi dan antibodi spesifik tertaut enzim
dimasukkan dalam sumur polipropilena yang sebelumnya telah diisi
dengan antigen spesifik.
Terjdi kompetisi ikatan antara Antibodi dan antibodi spesifik tertaut
enzim dengan antigen spesifik
membilas mikrotiter untuk membuang antibodi spesifik tertaut enzim
signal atau antibodi yang tidak berinteraksi dengan antigen spesifik.
Kelebihan dan Kekurangan Competitive ELISA
Kelebihan:
Tidak diperlukannya purifikasi terhadap larutan sampel yang mengandung
antibody atau antigen yang diinginkan, tapi hasil yang diperoleh tetap
memiliki tingkat sensitivitas tinggi akibat sifat spesitifitas dari antibody dan
antigen.
Kekurangan
Terjadinya kompetisi antara antibodi dan antibodi tertaut enzim sehingga
dikhawatirkan dapat menghambat ikatan yang terjadi pada antigen spesifik
Thank You for Your Attention

Tugas:
Mencari contoh aplikasi ELISA pada bidang analis medis (minimal 3)
dengan disertai ringkasan teknik-teknik analisisnya.
Ditulis tangan di folio bergaris.
Artikel dilampirkan
Dikumpulkan pada pertemuan berikutnya.