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BIORREACTORES PARA

EL CULTIVO DE
CLULAS DE ANIMALES
Y PLANTAS
Carolina Gutirrez Cisneros
Ricardo Hernndez Medina
Ral Montero Faras

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CARACTERSTICAS
GENERALES
Bacterias y Clulas Clulas de
Caracterstica
levaduras vegetales mamfero
Tamao 2-10 m 10-100 m 10-30 m
Tiempo de duplicacin 1-2 h 2-7 h 20-50 h
Sensibilidad al
Baja Moderada Alta
esfuerzo de corte
Medio de cultivo Simple Complejo Complejo
Temperatura 26-36 C 25-27 C 29-37 C
Aireacin Alta Baja Baja
pH 3-8 5-6 7.0-7.4
Escalamiento Fcil Difcil Difcil

(Prtner, 2009) 2
CONSIDERACIONES
GENERALES
Consumo de oxgeno
Produccin de CO2
Acumulacin de lactato y amonaco
Esfuerzo de corte
Anclaje o crecimiento en suspensin

(Prtner, 2009) 3
ABASTECIMIENTO DE
OXGENO

Superficie Membrana Burbujeo

(Czermak et al, 2009) 4


AIREACIN POR
BURBUJEO
Alta tasa de
transferencia de
O2

Dao celular y
formacin de
espuma
(Czermak et al, 2009) 5
AIREACIN POR
MEMBRANAS

Alta transferencia de oxgeno


j

No hay dao celular por burbujeo ni


formacin de espuma

Complica el proceso, mantenimiento


y limpieza
Transferencia de masa dependiente
de rea de membrana

(Czermak et al, 2009) 6


ESFUERZO DE CORTE

Flujo turbulento es ms daino que el


Flujo laminar

Burbujas pequeas causan mayor dao,


Burbujeo pero mejoran transferencia de O2

Composicin Mayor dao celular en medios sin suero


Uso de agentes protectores (Pluronic-
del medio F68/PEG) para estabilizar membrana

(Czermak et al, 2009) 7


INMOVILIZACIN
Necesaria para clulas dependientes de
anclaje
Proteccin a la clula del esfuerzo de corte
Mayor densidad celular en menos espacio
Facilidad de separacin de productos
extracelulares

(Czermak et al, 2009) 8


BIORREACTORES
PARA CLULAS
VEGETALES

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CARACTERSTICAS DEL CULTIVO VEGETAL
Metabolitos secundarios/ Protenas recombinantes

Produccin estril MEDIO


H2O
Fcil de controlar Medio Basal (C +
Procesamiento post-transcripcional suplementos)
Menor riesgo de contaminacin Murashige &
Skoog
Medio simple Fitohormonas
Matriz de soporte

Curva de crecimiento sigmoideo (fase lag larga)


Totipotencia
Menores tasas y efectos de cizallamiento
Acumulacin en vacuolas
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TIPOS DE CULTIVO VEGETAL
Masa amorfa de parnquima Homogenizacin
Superficie de respuesta Mayor variabilidad y
Esterilidad qumica heterogeneidad
Crecimiento necrtico Formacin de agregados
Friable/Lignificado Metabolitos secundarios
Flujo laminar

Agrobacterium rhizogens Micropropagacin y


Infectar/sumergir heridas fitomejoramiento
Divisin celular/elongacin
Fcil aislamiento y
crecimiento
Fitohormonas innecesarias
Estabilidad gentica y
bioqumica
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CARACTERIZACIN
Masa celular
Peso hmedo
Peso seco
Volumen empacado
Nmero celular
Agregados
Pectinasa, cido hidroclordrico etc.
Viabilidad
Aproximacin
Conductividad
Inverso a la masa celular
Osmolaridad
Refleja cambios pequeos de BM
pH
Consumo de nitrgeno/lisis celular

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BIORREACTORES

Fase lquida Fase gaseosa Hbrido


Sumergido Gotas humedecidas
Roco
Switches
Burbujeo
Vapor Carga
Inhibicin manual

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CULTIVO EN SUSPENSIN

Cultivos transgnicos vegetales


en suspensin: biorreactor
agitado
Aireacin
Directa
Ms eficiente
Fenmeno del crecimiento de pared
Indirecta
Contrarrestar
Antiespumante
Sistema + modo de ejecucin

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HAIRY ROOT

Distribucin no uniformeaglomeraciones
Agitacin no adecuada
Aislar
Soporte matricial
Inmovilizacin (fase gaseosa)
Limitacin por transferencia de masa
Idneo para crecimiento
Drenaje y absorcin
Aprovechamiento mximo
Modo de operacin: ebb and flow (flujo y reflujo)

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MODO DE OPERACIN

Produccin extracelular o asociada


al crecimiento: Fed-Batch
Produccin intracelular o no
asociada al crecimiento: Batch en
dos etapas

Induccin de metabolitos
secundarios
Perfusin

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APLICACIN
Transformacin gentica: GMP
2.5-25 veces menos que con clulas de
mamfero
20 protenas recombinantes distintas
PMP
45 aos: produccin de metabolitos
secundarios
cido rosamarnico
Ginsensidos

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BIORREACTORES
PARA CLULAS DE
MAMFERO

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CARACTERSTICAS DEL CULTIVO DE
CLULAS DE MAMFERO
Son grandes, crecimiento lento y sensibles al cizallamiento.
De anclaje: Crecen en superficie de vidrio, plsticos, polmeros
naturales (colgeno).
Suspensin: Cultivo en suspensin.
La concentracin es baja: metabolitos txicos como amonio y
lactato.

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CARACTERSTICAS DE LOS
REACTORES
Condiciones controladas: pH, T, DO.
Suministro de CO2
Relacin superficie-volumen en clulas de
anclaje
Constante remocin de agentes txicos o
productos de inters.
El reactor debe ser suavemente aireado y
agitado.
Agitados mecnicamente 20 rpm
Columna de burbujas y airlift: bajas tasas de
aireacin.

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BIORREACTORES
PARA CLULAS DE
INSECTO

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CARACTERSTICAS DEL CULTIVO DE
CLULAS DE INSECTO
Corto tiempo de duplicacin (~24 h)
Condiciones de crecimiento
28 C
6.2-6.9 de pH
CO2 PO43
>30 % dO2
Medio definido (libre de suero)
Ms sensibilidad al esfuerzo de corte

(Weber y Fussenegger, 2009) 30


INTERS INDUSTRIAL
Produccin de protenas recombinantes
Enzimas, anticuerpos, hormonas
Expresin gnica inducida a altas densidades
celulares
Infeccin por baculovirus

Por los fuertes promotores del sistema de


baculovirus, hasta el 50 % de la protena total
llega a ser la molcula recombinante.

(Weber y Fussenegger, 2009) 31


CONSIDERACIONES PARA EL
DISEO DEL PROCESO

Limitado a 48-72 h despus de infeccin


Tiempo de
Operacin discontinua o fed-batch
produccin
Instalacin simple

Caractersticas Bajo estrs de corte


del cultivo Suficiente abastecimiento O2

Biorreactor desechable
agitado por balanceo

(Weber y Fussenegger, 2009) 32


REACTOR DESECHABLE
AGITADO POR BALANCEO

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VENTAJAS
Bajo esfuerzo
cortante
Agitador
Burbujas
Mnima mano de
obra
Esterilizacin
Limpieza
Escalamiento
hasta 500 L
(Weber y Fussenegger, 2009) 34
ASPECTOS INGENIERILES
Transferencia de masa
Desarrollo y propagacin de ondas

Coeficiente de transferencia de oxgeno (kL)


Tasa de aireacin superficial
ngulo y tasa de balanceo

(Eibl et al, 2009) 35


REYNOLDS MODIFICADO
Permite determinar el tipo de flujo a partir de:
Volumen del reactor (V)
Velocidad de balanceo (k)
kVC
Nivel del lquido (h) Remod =
Ancho del reactor (B) (2h+B)
Viscosidad cinemtica ()

(Eibl et al, 2009) 36


REFERENCIAS
Czermak, P., Prtner, R. and Brix, A. (2009).
Special Engineering Aspects. Cell and Tissue
Reaction Engineering, pp.83-172.
Eibl, R., Werner, S. y Eibl, D. (2009). Bag
Bioreactor Based on Wave-Induced Motion:
Characteristics and Applications. Disposable
Bioreactors, pp.55-87.
Prtner, R. (2009). Characteristics of Mammalian
Cells and Requirements for Cultivation. Cell and
Tissue Reaction Engineering, pp.13-53.
Weber, W. y Fussenegger, M. (2009). Insect Cell-
Based Recombinant Protein Production. Cell and
Tissue Reaction Engineering, pp.263-277.
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