Fundamentos de la

Cromatografa Lquida (HPLC)

Dr. No Costilla Snchez
2016-I
Proceso general de una cromatografa lquida
Fundamentos de la Cromatografa Lquida de lata
Resolucin (HPLC)

Este curso le permitir a usted:

Explicar los principios generales del anlisis por
HPLC
Conocer las reas de aplicacin principales del
HPLC
Identificar los componentes principales del
sistema de HPLC y explicar sus principios de
operacin.
Tcnicas de Separacin Cromatogrficas
Cul es la tcnica se separacin para cada componente?
Qu es la cromatografa Lquida?
La cromatografa lquida es una tcnica de separacin que involucra:
- el lugar donde se inyecta un pequeo volumen de muestra
- un tubo empacado con partculas porosas (fase estacionaria)
- donde los componentes individuales de la muestra son transportados
a travs
del tubo empacado (columna) por un lquido movido por la gravedad
(fase mvil)
Los componentes de la muestra son separados uno del otro por el
empaque de la columna que incluye varias interacciones qumicas y
fsicas entre sus molculas y las partculas del empaque
Los componentes separados son colectados a la salida de la columna e
identificado por una tcnica de medida externa, tal como un
espectrofotmetro que mide la intensidad del color, u otro dispositivo
que puede medir su cantidad.
Nota: La moderna forma de la cromatografa lquida es ahora referida
como cromatografa flash
Principios de la Cromatografa Lquida
Entonces, qu es el HPLC?
HPLC es una abreviatura de Cromatografa
Lquida de Alta Resolucin (tambin se le
refiere como la LC a Alta Presin)
HPLC existe desde hace unos 40 aos y es la
ms grande tcnica de separacin que se
usa.
La historia de HPLC es:
- Nace en los aos 60 del siglo pasado
- Al final de los aos 70 se mejora el
material de la columna y la
instrumentacin del HPLC
- Despus de los aos 80 es el inicio del
boom del HPLC
- Despus del 2006 nuevos trminos han
aparecido como UPLC, RRLC, UFLC,
RSLC,
Qu es el HPLC?
HPLC es una tcnica de separacin que involucra:
- la inyeccin de un pequeo volumen de muestra
- en un tubo con partculas diminutas (3 a 5m de dimetro ) llamado la fase
estacionaria
- donde los componentes individuales de la muestra se mueven hacia el otro
extremo del tubo (columna) con un lquido forzado a travs de la columna
con alta presin suministrada por un a bomba.
Esos componentes son separados uno del otro por la columna de empaque
que incluye varias interacciones qumicas y fsicas entre sus molculas y las
partculas de empaque
Esos componentes separados son detectados al final del tubo (columna) por
un dispositivo que atraviesa el flujo (detector) que mide su cantidad. Una
salida de este detector es llamado ccromatograma lquido
En principio, el trabajo de LC y HPLC es de la miosma manera excepto que la
velocidad, eficiencia, sensisitividad y facilidad de operacin del HPLC es muy
superior
 Qu nos da un cromatograma lquido?
Qu nos presenta el cromatograma lquido?

Este es el cromatograma resultante de la inyeccin de un pequeo volumen de

extracto lquido de una cpsula de vitamina E que fue disuelto en un solvente
orgnico. Separaciones por HPLC moderno usualmente requieren de 10 a 30
minutos en cada separacin
Qu permite una alta presin en la cromtaografa lquida?
1. Bomba: el rol de la bomba es forzar a un lquido (fase
mvil) a travs del lquido cromatogrfico a un flujo
especfico, expresado en mL/min.
- velocidad de flujo normal en HPLC estan en el
rango de 1 a 2 mL/min
-bombas tpicas pueden alcanzar presiones en
rango de 6000-9000 psi (400 a 600 bar)
Durante un experimento cromatogrfico, una
bomba puede proporcionar una fase mvil de
composicin constante (isocrtica) una fase
mvil de composicin que se incrementa
(gradiente)
2- Inyector:
El inyector sirve para introducir la muestra lquida en el flujo mvil de la fase mvil
Volmenes de muestra tpica estn de 5 a 20 L
El inyector debe tambin ser capaz de soportar la alta presin del sistema
lquido.
Un auto muestreador es la versin automtica para cuando el usuario tiene
muchas muestras para analizar o cuando una inyeccin manual no es prctica.
3- Columna:
Considerado el corazn de la cromatografa la fase estacionaria de las
columnas separan los componentes de la muestra de inters usando varios
parmetros fsicos y qumicos
Las partculas internas de la columna que causan la contrapresin a
velocidad de flujo normal
La bomba debe empujar con fuerza para mover la fase mvil a travs de
la columna y su resistencia causa una alta presin en el cromatgrafo
4-) Detector:
El detector puede ver (detectar) las molculas individuales que salen fuera
(eluyen) de la columna.
Un detector sirve para medir la cantidad de esas molculas tal que el
qumico puede analizar cuantitativamente los componentes de la muestra
El detector proporciona una un registro o computador que resulta en el
cromatograma lquido (ejemplo la grfica de la respuesta del detector)
5-)Computador:
Frecuentemente llamado la base del sistema, el computador no solamente
controla a todos los mdulos del instrumento HPLC sino que toma la seal del
detector y lo usa para determinar el tiempo de elusin (tiempo de retencin) de
los componentes de la muestra (anlisis cualitativo) y la cantidad de la muestra
(anlisis cuantitativo)
Para que se usa el HPLC?
Separacin y anlisis de compuestos no voltiles termicamente inestables
HPLC es ptimo para la separacin de compuestos qumicos y biolgicos
que son no voltiles
Nota: si un componentes es voltil (por ejemplo gas, fragancias,
hidrocarburos en gasolina, etc.), la cormatografa gaseosa es una tcnica de
mejor separacin
Tpicos componentes no voltiles son:
Productos farmacuticos, como la aspirina, el ibuprofeno o
acetaminofeno(Tylenol)
Sales como cloruro de sodio y fosfato de potasio
Protenas como clara de huevo o protena de sangre.
Compuestos orgnicos como polmeros (por ejemplo poliestireno,
polietileno)
Hidrocarburos pesados como asfalto o aceite de motor
Muchos productos naturales tales como ginseng, hierbas medicinales,
extracto de plantas
Compuestos trmicamente inestables tales como trinitrotolueno (TNT),
enzimas
Para que se usa el HPLC?
Anlisis Cualitativo
La identificacin de compuestos individuales en la muestra;
Los parmetros ms comunes para la identificacin de compuestos es su tiempo
de retencin (el tiempo es tomado para esos compuestos especficos que eluyen
de la elusin despus de la inyeccin);
Dependiendo del detector usado, la identificacin del compuesto es tambin
basado en la estructura qumica, peso molecular o algunos otros parmetros
moleculares
Para que se usa el HPLC?
Anlisis cuantitativo
La medida de la cantidad de compuesto en la muestra (concentracin); significado,
cunto hay?
Hay dos formas de interpretar un cromatograma (por ejemplo, perfomance de la
cuantificacin)
Con el fin de hacer una evaluacin cuantitativa del compuesto, una muestra con una
cantidad conocida del compuesto de inters es inyectado y su altura de pico rea
de pico es medido. En muchos casos, hay una relacin lineal entre la altura rea y
la cantidad de la muestra
Para que se usa el HPLC?
Preparacin de compuesto (s)
Mediante la coleccin de los picos cromatogrficos en la salida del detector
Y concentracin del compuesto (analito) por remocin o evaporacin del
solvente,
Una sustancia pura puede ser preparada para su uso posterior (por ejemplo
sntesis orgnica, estudios clnicos, estudios toxicolgicos, etc)
Esta metodologa es llamada cromatografa preparativa.
Ejemplos de diferentes instrumentos y configuraciones

Instrumentos

Sistema de HPLC modular Sistema de HPLC modular Sistema HPLC integrado

De configuracin bsica de alta gama, con bomba
con bomba isocrtica, cuaternaria,
inyector manual, detector automuestreador,
de longitud de onda columna termostatizada,
variable y controlador de detector de arreglo de
mano diodo, y computador con
control y anlisis de datos
SW
todas las partes en una caja
con diferentes configuraciones
posibles, aqu con bomba
gradiente, auto muestreador,
columna con horno, VWD, y
computador con control y
anlisis de datos (no se muestra
en la foto)
Un vistazo a los mdulos individuales
Mdulo de bomba, tipos::
Bomba iosocrtica - proporciona una fase mvil de composicin constante
El solvente debe ser pre-mezclado
Costo de bomba mucho menor
Bomba gradiente proporciona fase mvil de composicin variable;
Puede ser usada para mezclar para proporcionar fase mvil isocrtica fase
mvil gradiente
Bomba gradiente binaria proporciona dos solventes

Bomba gradiente cuaternaria - cuatro solventes

Condiciones Gradiente vs Isocrtica
Isocrtica
Composicin de solvente de fase
mvil permanece constante con el
tiempo
Mejor para separaciones simples
A menudo usado en aplicaciones
de control de calidad que apoyan y
estan en estrecha proximidad al
proceso de fabricacin
Gradiente
Composicin de solvente de fase
mvil incrementa con el tiempo
Mejor para el anlisis de muestras
complejas
A menudo usado en desarrollo de
mtodo para muestras
desconocidas
Gradientes lineales son ms
populares (por ejemplo, la
gradiente que se muestra a la
derecha)
Porqu la Gradiente de Fase Mvil es Usada en HPLC?
Inyeccin de Muestra
como es una muestra real colocada en un sistema LC
Inyector Manual
1. El usuario carga manualmente la muestra en el
inyector usando una jeringa
2. Y luego manualmente se inyecta la muestra en
el flujo de la fase mvil
el cual transporta la muestra desde el
inicio de la columna (cabeza), el cual es a una alta
presin
Auto muestreador
1. El usuario carga viales con soluciones de muestra
en la bandeja del auto muestreador (100 muestras)
2. Y el auto muestreador automticamente
(a) Mide el volumen de muestra apropiado
(b) Inyecta la muestra
(c) Luego limpia el inyector para que quede listo
para la prxima muestra, et., hasta que todos
los viales han sido procesados
.. Para el funcionamiento automtico sin
supervisin
Columnas HPLC
Dentro de la columna es donde ocurre la separacin
Punto clave Seleccin adecuada de la columna es fundamental para
el xito en HPLC
Tipos de columnas en HPLC:
Analtica (dimetro interno de 1.0 a 4.6 y longitud de 15 a 250 mm)
Preparativa (dimetro interior > 4.6 y longitud de 50 a 250 mm)
Capilar ( dimetro interior de 0.1 a 1.0 mm; varias longitudes)
Nano ( dimetro interior < 0.1 mm, o a veces se indica como <
100 m)
Materiales de construccin para los tubo
Acero inoxidable (lo ms popular; da capacidad
de alta presin)
Vidrio ( sobre todo para molculas)
Polmero PEEK (biocompatible e inerte
qumicamente a muchos solventes)
Materiales de Empaque para Columnas HPLC
Columnas son empacadas con partculas porosas de dimetro pequeo
- Los tamaos ms populares son: 5, 3.5 y 1.8 m
Columnas son empacadas a alta presin para asegurar que ellos sean estables
durante el uso
- muchos usuarios compran columnas pre-empacadas para usarlos en sus
cromatgrafos lquidos
Esas partculas porosas en la columna usualmente tienen una fase enlazada
qumicamente en su superficie que interaccionan con los componentes de la
muestra para separar unos de otros
- por ejemplo, C18 es una fase enlazada muy empleada
El proceso de retencin de los componentes de la muestra (a menudo llamados
analitos) son determinados por la seleccin del empaque de la columna as
como de la fase mvil para empujar los analitos a travs de la columna de
empaque
Tpicos Mecanismos de una Separacin por HPLC
Modos de Separacin en HPLC
Punto clave a recordar:
La correcta seleccin del empaque de la columna y la fase
mvil son los factores ms importantes en el xito de un
HPLC
Hay cuatro modos de separacin principales que son
usados para separar muchos compuestos:
1- Cromatografa de fase reversa
2- Cromatografa de fase normal y adsorcin
3- Cromatografa de Intercambio inico
4- Cromatografa de exclusin por tamao

. Brevemente veamos cada modo

1- Cromatografa de Fase Reversa (RPC)
El empaque de la columna es no polar
(ejemplo C18, C8, C3, fenil, etc) y la fase mvil
es ahua(buffer) + agua-solvente orgnico
miscible (ejemplo metanol, acetonitrilo)
RPC es por lejos, el modo ms ampliamente
usado. Ms del 90% los cromatgrafos usan
este modo
La tcnica puede ser en molculas ionizables
y inicas no-polar, polar. Haciendo a RPC muy
verstil
Para muestras que tienen un amplio rango de
compuestos, elusin en gradiente es a
menudo usado Unos inician con una
fase mvil basado predominantemente en
agua. Los solventes orgnicos aumentan la
fuerza del solvente y eluyen compuestos que
estn muy fuertemente retenidos en el
empaque de RPC
2- Cromatografa de Fase Normal Adsorcin
En este modo de empaque el
empaque de la columna es polar (por
ejemplo, slica gel, cianopropil
enlazado, amina enlazada, etc) y la
fase movil es no polar (por ejemplo
hexano, isoctano, cloruro de
metileno, acetato de etilo)
Separaciones de fase normal son
menos desarrollados en un 10%
La tcnica es til para:
- compuestos sensibles al agua
- ismeros geomtricos
- ismeros cis-trans
- separaciones de clase
- y compuestos chirales
3- Cromatografa de Intercambio Inico
En intercambio inico, el empaque de columna contiene grupos inicos (por
ejemplo, sulfnico, tetralquilamonio) y la fase mbil es una buffer acuosa (por
ejemplo, fosfato, formato, etc.)
El intercambio inico es usado por cerca del 20% de los cromatgrafos
lquidos
La tcnica es muy adecuada para:
- la separacin de cationes y aniones inorgnicos y orgnicos en solucin
acuosa
- Tintes inicos, aminocidos, y protenas pueden ser separados por
intercambio inico por que tales compuestos son sales en agua salada,
4- Cromatografa de Exclusin por Tamao (SEC)
En SEC, no hay interaccin entre los compuestos de la muestra y el material de
empaque de la columna. En lugar, las molculas se difunden en los poros de
un medio poroso. Dependiendo de su tamao relativo al tamao del poro, las
molculas son separados. Molculas ms grandes que la apertura de un poro
no se difunde en las partculas. Grandes molculas eluyen primero. Molculas
ms pequeas eluyen despus.
La tcnica SEC es usada por los cromatgrafos en un 10-15%, principalmente
para la caracterizacin de polmeros y protenas
Hay dos modos:
- SEC no acuoso (algunas veces denominado Cromatografa de Permeacin
por Gel (GPC) y
- SEC acuoso (algunas veces referido a la cromatografa de Filtracin por Gel
GFC)
Mecanismo de SEC
Control de Temperatura en HPLC
Porqu es necesario?
Reproducibilidad
La retencin en el HPLC es dependiente de la temperatura
Si la temperatura vara, luego es difcil asignar picos a los compuestos
especficos en el cromatograma y el rea de pico altura puede variar

Solubilidad
Ciertos compuestos qumicos pueden tener baja solubilidad en el HPLC
Si ellos son inyectados en la corriente que fluye ellos pueden precipitar u otras
dificultades puede producir

Estabilidad
Ciertos compuestos qumicos, especialmente compuestos biolgicos tales
como enzimas o protenas, pueden no ser estable a la temperatura del cuarto
o ms alta.
La temperatura debe ser mucho menor a 4 C
Cmo se logra el control de la Temperatura?
Tres maneras de la temperatura de una columna podran ser controladas,
para ello puede usar:
1. Horno
2. Bloque de calentamiento
3. Bao de agua
Deteccin en HPLC
Hay muchos principios de deteccin usado para
detectar compuestos que eluyen de una columna
HPLC

Los ms comunes son:

Deteccin espectroscpica
Deteccin con indice de refraccin
Deteccin de fluorescencia
Deteccin Espectroscpica
Absorcin Ultraviolesta (UV)
Un haz de luz ultravioleta es dirigido a travs de un flujo a la celda y un sensor
que mide el paso de luz a travs de la celda
Si un compuesto eluye de la columna que absorbe esa energa de la luz, esto
cambiar la cantidad de la energa de la luz decae en el sensor
El cambio resultante en esta seal elctrica es amplificada y dirigida a un
registrador o sistema de datos
Un espectro UV es algunas veces tambin obtenido el cual puede ayudar en la
identificacin de un compuesto o serie de compuestos
Deteccin Espectroscpica
Espectroscopa de Masas (MS)
Un detector MS detecta un compuesto que eluye de una columna HPLC primero
por ionizacin, luego la medida de su masa y/o fragmentacin de la molculas
en piezas ms pequeas que son nicas del compuesto.

Esto es un espectro de
masa de un simple
compuesto qumico. El
pico ms grande en el
espectro ocurre a una
masa de 91, el cual es un
ion fragmento generado
por una prdida de un
tomo de hidrgeno
Detector Indice de Refraccin (RI)
La habilidad de un compuesto o solvente para desviar la luz es una manera de
detectarlo
El RI es una medida de la habilidad de las molculas para desviar la luz en una
fase mvil que fluye en una celda de flujo de relativa a una fase mvil esttica
contenida en una celda de flujo.
La cantidad de desviacin es proporcional a la concentracin.
El detector IR es considerado a ser un detector universal, pero esto no es muy
sensible
Detector de fluorescencia
Comparado los detectores UV-Vis con los detectores de fluorescencia, ellos
ofrecen una alta sensibilidad y selectividad que permiten la identificacin y
cuantificacin de compuestos e impurezas en matrices complejas a niveles de
concentracin extremadamente bajos (anlisis de nivel de trazas)
Detectores de fluorescencia solamente detectan sustancias que fluoresencia
Definiciones y trminos cromatogrficos
1-) Factor de retencin
Factor de retencin factor de capacidad (k), se define
como la capacidad de migracin de un analito en una
columna determinada, su expresin matemtica es,

t r t0 Vr V0
k
t0 V0
tr : tiempo de retencin del analito en su mxima seal
t0 : tiempo que tarda la fase mvil en pasar a travs de la
columna
Vr : volumen de fase al tiempo de retencin del analito en
su mxima seal
V0 : volumen de fase mvil con la que atraviesa la columna
Definiciones y trminos cromatogrficos
2-) Eficiencia
El modelo del plato terico supone que la columna
cromatogrfica contiene un gran nmero de capas, llamadas
platos tericos. Los platos son un concepto imaginario que
ayuda a entender como funcionan los procesos de separacin en
la columna
La eficiencia de una columna N se mide por el nmero de platos
tericos, mientras mayor sean ellos mejor es la eficiencia d la
columna. As mismo mientras ms pequeo sea la altura del
plato terico (HEPT) mayor es tambin la eficiencia de la
columna.

HEPT = L / N

L : es la longitud de la columna
N : nmero de platos tericos
Definiciones y trminos cromatogrficos
2-) Eficiencia
El nmero de platos tericos (N) que posee una columna real se
puede calcular a travs del pico cromatogrfico de un
compuesto dado despus de su elucin. Con el pico mencionado
que puede representarse por un tringulo de base W en
unidades de tiempo y altura h en unidades de absorbancia
absoluta se tiene,
2
t
2
t
N 16 r 5.54 r
W W1 / 2
Tr : el tiempo de retencin del analito
W1/2 : base media del pico, que es la base del pico a la altura
media del pico
3-) La selectividad,
Se define como la capacidad de separacin de dos analitos en la
columna. Su expresin matemtica es la siguiente
Definiciones y trminos cromatogrficos

k 2' t2 t0 V 2 V0
'
k1 t1 t 0 V1 V0

t1, t2 : tiempos de retencin de analitos

V1, V2 : volmenes de retencin de los analitos
V0 : volumen muerto
3-) Resolucin, Rs
Es el parmetro que indica la calidad de una separacin, como
una medida numrica de la separacin entre dos compuestos, y
se define como,
V2 V1 t 2 t1
RS
1 / 2 (W2 W1 ) 1 / 2 (W2 W1 )
W1, W2 : bases de los picos 1 y 2 respectivamente
Definiciones y trminos cromatogrficos

Se deduce tambin que la ecuacin de la resolucin de dos picos

cromatogrficos de los solutos A y B son:

1 1 k 'B
RS NB
4 1 k ' B

Junto a la resolucin, otro factor importante en la cromatografa

es el tiempo necesario par eluir un par de solutos. Luego el
tiempo necesario para eluir el soluto B es,
2
16 R H
2
(1 k ' B ) 3
tr ,B
S

u 1 ( k ' B ) 2