Al terminar el curso el alumno debe

estar en capacidad de aplicar la

tcnica y la terminologa asociada a
los desarrollos en cromatografa
(HPLC)

1
ESPECFICOS:

Comprender todos los mecanismos de sorcin que gobiernan las

separaciones cromatogrficas (adsorcin, particin, intercambio
inico, exclusin, afinidad, etc ).

Relacionar los conceptos tericos fundamentales, con las variables

que afectan la separacin.

Evaluar y explicar la calidad de la separacin cromatogrfica en

funcin de parmetros como: factor de simetra de pico, plato
terico, nmero de platos tericos, factor de separacin y resolucin.

Reconocer la tecnologa asociada a la cromatografa lquida:

bombas, detectores, etc.
2
 Conocer la tecnologa de las columnas convencionales, su uso y
manejo, adems una descripcin qumica de las fases estacionarias
disponibles.

Diferenciar los mtodos y procedimientos utilizados como tcnicas

de cuantificacin en anlisis instrumental.

3
 El botnico ruso Mikhail Tswett (Mikhail Semenovich
Tswett, 1872-1919) emple por primera vez en 1906
el trmino "cromatografa" (que proviene del griego
y que significan respectivamente
chroma "color" y graphos "escribir") Escritura en
color.
A comienzos del ao 1903, Mikhail Tswett us
columnas de adsorcin de lquidos para separar
pigmentos vegetales (por ejemplo, Clorofilas). Las
soluciones se hacan pasar a travs de una columna
de vidrio rellena de carbonato de calcio o alumina,
usando eter de petrleo como solvente. En la medida
que la mezcla viajaba por la columna, cada pigmento
mostraba un grado propio en su capacidad de unirse
con el adsorbente. En esta forma los pigmentos
llegaban a ser separados como capas coloreadas en
el tubo.
La Cromatografa Lquida de Alta Eficiencia (HPLC)
comenz a desarrollarse en los aos 1960,
aumentando su importancia en las dcadas
siguientes, hasta convertirse en la tcnica
cromatogrfica ms empleada.
4
El proceso cromatogrfico puede ser definido como una
tcnica separativa que envuelve la transferencia de masa
entre una fase estacionaria y una fase mvil

5
 FASE MVIL

FASE ESTACIONARIA
HPLC usa una fase mvil
lquida para separar los
componentes de una
mezcla (ANALITOS)
Disueltos en un disolvente apropiado

FASE ESTACIONARIA
Forzados a pasar a travs FASE MVIL
de una columna
ALTA PRESIN

RESOLUCIN:
dependiendo de la
interaccin existente entre
los analitos, la fase
estacionaria y la fase mvil

http://www.gelifesciences.com/aptrix/upp01077.nsf/AttachmentsByTitle/RPC/$FILE/GE_Reversed+Phase.swf
6
La cromatografa lquida no est limitada por la volatilidad de la
muestra o por la estabilidad trmica de la misma

Protenas Polisacridos Polmeros sintticos

cidos
Pigmentos Surfactantes
nucleicos
Aminocidos Lpidos polares Frmacos
Metabolitos secundarios
Tintas Explosivos
(plantas, animales)

La cromatografa lquida es muy conveniente para la

separacin de macromolculas y de especies inicas

Bajas temperaturas en la separacin llevada a cabo en LC

7
8
El cromatgrafo lquido bsico consta de seis unidades
fundamentales: Una fuente de fase mvil, las bombas, la
vlvula de inyeccin de muestra, la columna, el detector y
finalmente un procesador de datos (computador)
9
EL CORAZN DEL SISTEMA
CROMATOGRFICO

10
11
Dipolos Inducidos Dipolo-Dipolo Puentes de Hidrgeno

Factores Estericos Interacciones Pi

http://www.science.uwaterloo.ca/~cchieh/cact/c123/intermol.html
 La fase estacionaria es capaz de
intercambiar iones, tiene cargas en su
superficie
SO32-, COO-, NH3, NR3

Tipo de In Intercambiador?
pH de la fase mvil?
Fuerza Inica (Concentracin) de la fase
mvil?

http://www.osmosistemi.it/index.php?option=com_content&view=article&id=90&Itemid=61&lang=en
Modo de cromatografa ms especfco
 Las Columnas de HPLC estn constituidas por partculas muy
pequeas, (usualmente de Slica) empacadas en un tubo de
acero, provocando:

Alta presin del sistema cuando el flujo es incrementado

Las limitaciones en el flujo provocan limitaciones en las longitudes

de las columnas y por ende en el mismo desarrollo de los mtodos.

Los tiempos de equilibrio y lavado de las columnas altos

Dentro de las columnas se pueden formar Volmenes Muertos los

cuales pueden provocar reducciones en la confiabilidad y
reproducibilidad de los anlisis

La alta presin reduce la vida de las columnas y provoca adems un

gran desgate de los sellos y el mismo equipo HPLC.
Superficialmente porosas
 La Silica como material de empaque
Los siguientes factores son importantes en la fabricacin de
columnas basadas en silica para HPLC:
La pureza (especialmente por el contenido de iones metlicos)
Porosidad
La Desactivacion / tratamiento superficial
La Hibridacin con grupos alquil
La forma (esfrica o irregular)
El tamao de partcula
La distribucin del tamao de partcula

19
Empaquetamiento de columnas fase ligada
FASES LIGADAS MAS USADAS
 FASE REVERSA: SEPARACIN DEFINICIN Y MECANISMO

La fase estacionaria es menos polar que la

fase mvil Mecanismo:
PARTICIN

Fase estacionaria:
C18
C8
Ciano
Amino
C4

Fase mvil:
Agua
Solventes orgnicos
Buffers
Modificadores
ORDEN DE RETENCIN EN FASE REVERSA
PREDIGA EL ORDEN DE ELUCIN

? ? ? ?
 Distintos tipos de interaccin entran en juego durante
el paso del analito a travs de la columna al ser
forzado por la fase mvil:
Interacciones hidrofbicas Puentes de hidrgeno
Interacciones dipolares y electrostticas
FASE ESTACIONARIA

El componente ms afn a la Fe se
FASE MVIL

retiene ms y tarda ms en eluir

El componente ms afn a la Fm
se retiene menos y eluye antes

Am Ae Bm Be
25
 Volumen de elucin:
Volumen de fase mvil eluida entre la inyeccin y la
elucin de la concentracin mxima de soluto

Caudal constante?

Volumen Muerto:

Es el volumen total del solvente entre el punto de

inyeccin y el de deteccin, con excepcin del
correspondiente al de las partculas de Fe. La
elucin de un analito que no se retenga en la fase
estacionaria no ser inmediata
26
 Lnea Base:
Porcin del cromatograma donde slo se aprecia la
elucin de la fase mvil, sin seal debida al soluto

Si la fase Mvil absorbe en el UV?

Tiempo de retencin:

tn= tn- t0
Tiempo de
retencin neto
27
{Factor de capacidad: (k)} Factor de Retencin: (k)

tn - t0 Vn- V0
k= k=
t0 V0
0 k
Cmo se ajusta el valor k?

28
Factor de separacin: (selectividad)
Es el cociente entre los factores de capacidad de un
par de picos
No depende de la fuerza de elucin
= k2
k1 Depende de la afinidad del soluto por
la fase mvil y por la fase estacionaria

UN CAMBIO EN LA FUERZA DE ELUCIN SER

PROPORCIONAL PARA TODOS LOS SOLUTOS DE LA
MEZCLA DE MANERA QUE EL COCIENTE SE
MANTIENE APROXIMADAMENTE CONSTANTE
29
 La selectividad ( o factor de separacin ()) se refiere a
la habilidad del sistema cromatogrfico para distinguir
QUIMICAMENTE entre los componentes de una
muestra.

Se puede visualizar como la distancia entre los mximos de

los picos

Por definicin el factor de separacin siempre ser

mayor que uno, cuando este valor es igual a uno
entonces los picos en cuestin COELUYEN
30
Valores de alfa grandes (>1.1) indican un buen poder de
separacin y una buena separacin entre los puntos
mximos de los picos en cuestin. Sin embargo el valor
no es un indicativo directo de la resolucin

31
La exitosa aplicacin de LC para la resolucin de un
problema determinado requiere la correcta combinacin
de las condiciones de operacin:

Rata de flujo
La fase mvil
Composicin

Empaquetamiento (tamao)
Dimetro
Longitud

TROUBLESHOOTING
32
 1

EFECTOS

2
segundo
parmetro ms
importante para
el correcto
desarrollo de un
mtodo
33
REQUERIMIENTOS

34
 Reservorios de la fase mvil

Solventes desgasificados ?

Pequeas burbujas de aire presentes en la fase

mvil pueden colectar otros componentes
(Cabezas de bombas, detectores)

Cuando se preparan fases mviles es importante usar

sales de alta pureza, pequeas partculas pueden
retenerse en los tubos de dimetro pequeo, o en las
columnas causando su deterioro

35
Almacenado en polietileno
Vidrio

Recipiente abierto

Elucin con Gradiente

cromatogramas generados usando
agua almacenada en:
(a) Polyethylene container;
(b) laboratory glassware
(c) open container

Columna C18, gradiente 100% agua hatsa 100% acetonitrilo en 20 min. 36

Solventes desgasificados ?

La presencia
de burbujas
de aire en la
fase mvil
puede
alterar de
manera
significativa
el buen
desempeo
del detector

37
 Solventes desgasificados ?
Hay cinco mtodos comnmente usados
en HPLC para degasificar las fases
mviles:

Purga con Helio

Degasificacin con Ultrasonido
Degasificacin por vaco
Reflujo
Degasificacin por vaco en Lnea

38
Lograr un buen mezclado
de los solventes - sin
precipitacin o formacin
de emulsiones
inmiscibles
Aplica a los solventes que estn
siendo usados en un anlisis en
particular o cuando se este se
esta cambiando en un
instrumento de fase reversa a fase
normal o viceversa

Composicin desconocida y irreproducible de la fase

mvil.

Pueden aparecer fluctuaciones en la lnea base.

Si se presentan trazas de solventes inmiscibles dado,

puede ocurrir una de-humectacin recubriendo las paredes
interiores del instrumento provocando problemas con al
fase estacionaria con los bferes y aun con la muestra.

39
40
Cuando se esta usando la deteccin con UV es necesario
seleccionar un solvente que no tenga una absorcin significativa
en el UV a la longitud de onda a las cuales van a ser realizadas las
mediciones

Hasta donde sea posible se recomienda que se use un solvente con

un punto de corte por de 20 nm por debajo de la longitud de onda
seleccionad parar el anlisis

41
Hay tres propiedades fundamentales de un solvente orgnico por
medio de los cuales este afecta la selectividad cromatogrfica:
El momento dipolar (la polaridad)
La acidez (donador de protones)
La basicidad (aceptor de protones)

42
 30% MeCN 45% MeOH
70% Water 55% Water

30x0.46 cm C-18, 1.5 mL.min, Snyder and Kirkland, introduction to

Modern Liquid Chromatography, Wiley,
254 nm, 10 mg each 1979, p. 287.
RPIDO

LENTO

EL MAS LENTO
Se usa un solo sistema de solventes, cuya composicin
NO cambia durante el tiempo del anlisis
Elucin por gradiente: UNA SOLUCIN
Se usa para anlisis de mezclas mas complejas, el gradiente se da
cuando cambia la fuerza de elucin de la fase mvil. Cambia su
composicin
VENTAJAS:

Mejora la resolucin
Incrementa la deteccin
Tiempos de anlisis cortos
Disminuye el deterioro de las
columnas

OTROS USOS:
Limpieza de columnas
Corridos exploratorios para el
desarrollo de mtodos
 La composicin inicial es Durante el anlisis con
escogida de tal manera que gradiente la composicin de
la fortaleza sea la apropiada la fase mvil es mezclada en
para retener y resolver los lnea por el sistema d
primeros picos que eluyen. bombeo. Dos cabezas de
bombas pueden ser
La fortaleza de la fase mvil
empleadas para mezclar dos
se aumenta de forma que
solventes (sistema binario) o
eluyan eluyan el resto de los
una cabeza de bomba puede
analitos con buena
ser usada en conjuncin con
resolucin.
un dispositivo de mezcla
La composicin final se controlado electrnicamente
escoge de tal manera que se para mezclar dos solventes
asegure la elucin de todos (binaria), tres solventes
los compuestos de interes en (ternaria) y cuatro solventes
un tiempo razonable. (cuaternaria).
Es posible incrementar el
contenido de modificador
orgnico hasta una
concentracin ms alta, para
lavar los analitos altamente
retenidos (contaminaciones).
Un gradiente bsico puede ser:
0:100 Acetonitrilo Agua hasta 60:40 Acetonitrilo Agua
en 60 minutos, lo que produce un incremento de la
concentracin de Acetonitrilo del 1% por minuto

Un gradiente puede ser lineal

(como el que se describi),
convexo o cncavo, o una
compleja secuencia de cada
uno para obtener la
separacin deseada
FORMA DEL GRADIENTE
Por que los picos durante una elucin por gradiente son
angostos?

El coeficiente de particin
para la elucin de los analitos
de la columna es pequeo (la
velocidad es alta) y similar
para ambos compuestos

Las colas de los picos

experimentan altas
concentraciones de
modificador orgnico, por lo
tanto las colas de los picos
aumentan su velocidad
causando la disminucin del
ancho de pico
Cambios en el orden de elucin: un fenmeno del gradiente
Por qu escoger una elucin por gradiente ?
Para separar componentes que
Caso 1
varan ampliamente en polaridad
 Por qu escoger una elucin por gradiente ?
Para separar mezclas con un gran
Caso 2 nmero de componentes de bajo peso
molecular
Analysis of Pesticides in Drinking Water
 Por qu escoger una elucin por gradiente ?
Para separar mezclas con componentes de
Caso 3 alto peso molecular (pptidos y protenas)
Gradient Separation of Peptides
Eficiencia dependiente del flujo
Consideraciones prcticas para la elucin con gradiente

El solvente debe ser lo mas

puro posible para que no
aparezcan picos fantasma

Se debe tener certeza de la

solubilidad del buffer con la
composicin final de la fase
mvil

se debe tener en cuenta un

tiempo prudente para el
reacondicionamiento de la
columna luego de cada
corrido
 Afecta los compuestos ionizables

cidos orgnicos
Bases Orgnicas

Es necesario un control preciso del pH

59
Efecto del pH sobre la retencin
1. Salicylic acid
2. Phenobarbitone
3. Phenacetin
4. Nicotine
5. Methylampohetamine

30x0.4 cm C-18, 10 mm, 2

mL/min, UV 220 nm

Snyder and Kirkland, Introduction to Modern

Liquid Chromatography, Wiley, 1979, p. 288.
 Ionizacin y retencin en RP - HPLC

Para un analito bsico

A B C
A. Analito completamente
protonado (forma catinica)
baja retencin

B. Regin de baja protonacin

coexisten las dos formas del
analito (protonada y
desprotonada)

C. Analito en forma neutra (la

forma ms hidrofbica)
Dependencia general de la retencin de un
analito bsico con el cambio de pH da la fase
mvil
Buffer Cut off
Solubilidad de las sales
20-50 mM

62
Es la medida de la dispersin de la banda
del analito en la medida que ste viaja a
trves de la columna y el sistema
cromatogrfico
El nmero de platos tericos
(N), es la medida de la
dispersin del pico en la
columna cromatogrfica de
HPLC, reflejando la
eficiencia de la columna

W0.6065h h
W0.5h

WB= 4

2
t tR
N = 16 Columna
Wb N ms
wb eficiente 64
 1/2
Consideramos efectos como: N
w = tR
4
Difusin de EDDY
Difusin Longitudinal
Resistencia a la transferencia de masa

Todos estos efectos son gobernados por

procesos cinticos que afectan el ancho de
banda
 ENSANCHAMIENTO DE BANDA TOTAL
L L: longitud de la columna.
H
N N: nmero de platos tericos. B
H=A+ +C U
U

A : proceso multipaso

B
Difusin longitudinal
U
CU Transferencia
de masa
El resultado mas significativo es que se puede buscar un
flujo optimo de la fase mvil donde la eficiencia de la
columna sea la mejor
 A Proceso multipaso (difusin de EDDY)

Se presenta a causa de los distintos caminos que puede

recorrer el soluto impulsado por la fase mvil
Constante que
Hi = dp depende del relleno y
dp Diametro de partcula
de la calidad del
empaquetamiento
 B DIFUSIN LONGITUDINAL

Es el proceso de difusin
inherente a las partculas de
soluto
A menor caudal mas notorio el proceso de
difusin longitudinal
Evala el espacio
ocupado por la fase
Hi = Dm 1 B
Hi = Dm
mvil
U U Difusin del soluto en el
solvente
Resistencia a la transferencia de masa (Fm y Fe)

Las molculas de soluto ms favorables a la interaccin

con la fase estacionaria son las mas cercanas a esta,
mientras las mas alejadas tardaran ms tiempo para que
esta interaccin tenga lugar

dp Constante que depende del

dimetro de partcula

Coeficiente determinado por la

distribucin de tamao de poro
Efecto de la concentracin de muestra
Reduciendo simultneamente la longitud de la columna y el
tamao de partcula, usted puede:

Mantener la resolucin
Reducir el tiempo del anlisis
Reducir el gasto de solvente
Desarrollar un muy alto nmero de platos
para reducir el tiempo de anlisis sin
comprometer la resolucin entre los pares de
picos mas crticos 72
73
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