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t' v'
R R k'
t x x x
i , std t' v' k
R R std
std std
Aplicaciones de la Cromatografa
Informacin cualitativa
no hay seguridad en la identificacin
hay evidencia en la ausencia de ciertos
constituyentes
la informacin espectroscpica se fortalece si
se realiza una cromatografa previa.
Anlisis Cromatogrfico
Cuantitativo
uso de planmetros
Columnas
Empacadas
Analticas
Preparativas
Capilares
WCOT ( Wall Coated Open Tubular)
SCOT (Support Coated Open Tubular)
Alimentacin de gases
Componentes necesarios
Controladores de flujo/presin del gas
Dispositivos para purificar el gas (trampas)
3
4 6
2
1
1. Cilindro
2. Regulador de presin primario
3. Trampas para eliminar impurezas
4. Regulador de presin secundario
5.Regulador de flujo (controlador diferencial de flujo)
6. Medidor de flujo (rotmetro)
A = 99,995 % (4.5)
C B = 99,999 % (5.0)
COSTO
B C = 99,9999 % (6.0)
A
PUREZA
Gas portador
Compatible con el detector
Cada detector demanda un determinado gas
de arrastre
DCT He , H2
DIC N2 , H2
t=x
Inyeccin instantnea
t=0
t=x
Inyeccin lenta
t=0
t=x
Inyector en columna convencional
1
2 1. Septo (silicona)
2. Alimentador de gas
3 de arrastre
3. Block metlico de
4
calentamiento
4. Punta de la
columna
cromatogrfica
Inyeccin en columna de lquidos
1 2 3
cuerpo (pyrex)
Microjeringas para inyeccin
Microjeringa de 1 L
guia
mbolo (hilo de acero)
Esquema de un puerto de inyeccin por vaporizacin
instantnea tpico
(a) Vlvula rotatoria con seis puertos
(b) vlvula de placa deslizante
Mtodos de Inyeccin
Si se introduce
mucha muestra puede
sobrecargar la lnea.
Puede perderse parte
de la muestra por la
salida de purga.
Ud debe cuidar que el
volumen de muestra
sea menor que el
volumen de la lnea.
Inyeccin Split
Paso 2: purga on
Modo split
Cmo Trabajar?
lenta rpida
Inyeccin con jeringas
Cuando se usa una jeringa, Ud. ve cuanta
muestra hay en el cuerpo de la jeringa pero no en
la aguja.
Durante la inyeccin, parte de la muestra puede
volatilizarse en la punta de la aguja, causando
mayor imprecisin.
Esto puede provocar discriminacin entre los
componentes de la muestra, esto es peor en las
inyecciones en las columnas capilares.
Mtodos de Inyeccin
Columnas y hornos de columnas
Generalmente son:
Capilares o tubulares
Empacadas o de relleno
Normalmente son:
De 2 a 50 m de longitud
Construidas de acero inoxidable, vidrio, slice
fundida o tefln
Enrolladas en forma helicoidal con de 10 a 30
cm, segn tamao del horno de columna
Columna Empacada
COLUMNAS CAPILARES
Tipos de columnas
Empacadas Capilares
Columnas Capilares
a) Dimensiones tpicas de las columnas capilares o
tubulares abiertas usadas en GC
b) columna cromatogrfica de slice fundida. El del
rollo es de 20 cm y la longitud tpica de las columnas es
entre 15 y 100 m
Columnas Capilares
c) Seccin transversal de columnas de pared recubierta de
fase estacionaria lquida, slida y de capa porosa
Fases Estacionarias
Lquidos depositados sobre una superficie de
slido poroso inerte (columna empacada) o
En tubos finos de material inerte (columnas
capilares)
FE
lquida
SUPORTE Tubo capilar de
Slido inerte material inerte
poroso
Fases Estacionarias
Para minimizar la prdida de FE lquida
por volatilizacin, normalmente el soporte
es:
FE poco Selectiva:
mala resolucin an
con una columna de
buena eficincia
Fases Estacionarias
Caractersticas de una FE ideal
Amplio rango de temperaturas de uso
Mayor flexibilidad para optimizar la separacin
Buena estabilidad qumica y trmica
Mayor durabilidad de la columna, no reaccionar
con los componentes de la muestra
////
Fases Estacionarias
Poco viscosa
Columnas ms eficientes: menor resistencia a la
transferencia del analito entre las fases
Disponible con elevado grado de pureza
Columnas reproducibles: ausencia de picos
fantasmas en los cromatogramas
Soporte y Fases Estacionarias
Soporte y Fases Estacionarias
Columnas y hornos de columnas
Como la temperatura es una variable importante
en la separacin de los diferentes analitos, el
horno de columna debe permitir:
Ajustar la T con una precisin de dcimas de grado
Ajustar la T a valores semejantes al punto de
ebullicin del analito o ligeramente superiores
Usar rampas de temperaturas cuando hay varios
analitos con distintos p. eb.
Columnas y hornos de columnas
Es recomendable:
Utilizar temperaturas bajas para la elucin,
para evitar descomposicin del analito
Uso de temperaturas bajas para disminuir
riesgos de alteracin de la fase estacionaria
o de la columna
No olvidar que las columnas soportan hasta
ciertas temperaturas, generalmente
alrededor de 300C.
Polietilenglicol: muy polar, sensibles a la humedad y oxidacin
Carbowax, Supelcowax, HP-Wax, etc..
CL - LC
Cromatografa Lquida
La cromatografa lquida clsica se lleva a
cabo en una columna de vidrio, la cual est
rellena de fase estacionaria, luego se
siembra la muestra en la parte superior y se
hace fluir la fase mvil a travs de la
columna por efecto de la gravedad.
Cromatografa Lquida
Con el objeto de mejorar la eficiencia en
las separaciones, el tamao de las
partculas de la fase estacionaria se fue
disminuyendo hasta el tamao de los
micrones, lo cual gener la necesidad de
utilizar altas presiones para lograr que
fluya la fase mvil, de esta manera naci la
tcnica de HPLC.
Tipos de cromatografa lquida
Cromatografa de particin: para especies
poco polares pero no inicas
Cromatografa de adsorcin: se aplica a
especies no polares, ismeros estructurales,
grupos de compuestos
Cromatografa inica: para especies inicas
Cromatografa de exclusin: para solutos
de masas moleculares mayores a 10 000
Cromatografa Lquida de Alta
Resolucin
HPLC
Cromatografa lquida HPLC
Uno de las tcnicas ms utilizadas hoy por su:
gran sensibilidad
Capacidad para proporcionar determinaciones
cuantitativas exactas
Permite separar sustancias no voltiles o
termolbiles
Gran aplicacin en la industria
Gran campo de aplicacin
Cromatografa lquida HPLC
Gran campo de aplicacin:
Plaguicidas
Hidrocarburos
Aminocidos
Protenas
cidos nucleicos
Azcares
Drogas
Terpenoides
Etc..
Cromatografa lquida HPLC
Eficiencia de la columna en HPLC
Todos los aspectos generales vistos previamente
sobre el ensanchamiento de los pick en la
cromatografa en columnas toman mayor
relevancia en la LC, donde se destacan:
El efecto del tamao de la partcula de relleno de la
columna
El ensanchamiento extracolumna
Efecto del tamao de muestra
Cromatografa lquida HPLC
El efecto del tamao de la partcula de
relleno de la columna
La eficiencia de una columna de HPLC
debera mejorar si disminuye el tamao de las
partculas de relleno, experimentalmente se
han obtenido reducciones del ancho de banda
de diez y > cuando el tamao de las partculas
ha disminuido unas 8 veces ( ej: de 45 a 6
m)
Cromatografa lquida HPLC
El ensanchamiento extracolumna
Corresponde al ensanchamiento de la banda
cromatogrfica fuera de la columna durante el
transporte de la muestra:
a travs de los tubos de los sistemas de inyeccin,
A travs de los detectores
A travs de los conectores del sistema
r u 2
H ex
24 DM
Cromatografa lquida HPLC
El ensanchamiento extracolumna
Ocurre por las distintas velocidades de flujo que
existen en los lquidos si estn cerca de las paredes
de los tubos o estn en el centro, la porcin que se
encuentra al centro del tubo se mueve con ms
rapidez que las de la perisferia.
Esto es ms notorio cuando se utilizan columnas de
dimetro pequeo.
El control va en la reduccin de los tubos del sistema
fuera de la columna
Cromatografa lquida HPLC
Efecto del tamao de muestra
Se observa una disminucin del ancho de
banda al disminuir la cantidad de muestra,
dependiente del mecanismo de separacin:
> H : reparto adsorcin
< H : rellenos con fase enlazada en fase reversa o
inversa
Instrumentacin para la
Cromatografa Lquida
Una de las necesidades de la
instrumentacin en la LC es lograr un
caudal de eluyente que pueda circular por
los rellenos de la columna, normalmente
entre 3 a 10 m, por lo que se requieren
altas presiones.
Instrumentacin para la
Cromatografa Lquida
Componentes:
Recipiente para fase mvil y tratamiento de los
disolventes
Sistema de bombeo
Sistemas de inyeccin de muestras
Columnas cromatogrficas
Detectores
Sistemas de adquisicin y tratamiento de datos
Instrumentacin para la
Cromatografa Lquida
Esquema probable de un
cromatgrafo isocrtico
Recipientes para fase mvil
Material:
vidrio
acero inoxidable
Puede complementarse mediante:
sistemas desgasificadores:
sonificacin, burbujear He, vaco, etc..
filtros
Fase mvil
Separacin con un solo disolvente de
composicin constante:
ELUCIN ISOCRTICA
Neumticas
Sistema de inyeccin de muestras
Sistema de inyeccin en HPLC
Columnas
Tubos de acero inoxidable de dimetro uniforme,
empacadas que difieren en su relleno y tamao
Columnas analticas:
10 30 cm, o menores
Se pueden acoplar ms columnas
Dimetro interno 4 a 10 mm
Partculas de relleno comunes 3,5, 10 m
40 000 60 000 platos/m, o ms
Precolumnas: evita deterioro de la columna
analtica
Hornos de Columnas
Normalmente las columnas trabajan a
temperatura ambiente
Pero es posible mejorar las separaciones
utilizando temperaturas controladas hasta
0,1, permiten normalmente hasta 150C
Rellenos de Columnas
Rellenos:
Pelicular
Partculas porosas: micropartculas porosas
de dimetros entre 3 y 10 m
Rellenos de Columnas
Cromatografa de reparto:
De fase normal: la fase estacionaria de
elevada polaridad
De fase reversa o inversa: la fase estacionaria
no polar generalmente un hidrocarburo y la
fase mvil relativamente polar: ej. Agua,
metanol, acetonitrilo
Detectores
Detector de ndice de refraccin
Detector de fluorescencia
Detector UV
de longitud de onda fija
de longitud de onda variable
De arreglo de diodos
Detector electroqumico
Amperomtrico
conductimtrico
Detector de Arreglo de Diodos DAD
DAD
Imagen 3D
Sistemas de separacin
Seleccin de la columna
Seleccin de la fase mvil
k
Derivatizacin:
Tipos:
Precolumna
Postcolumna
Finalidad:
Para reducir polaridad de las especies
Para aumentar respuesta del detector
Para aumentar selectivamente la respuesta del detector
Problemas comunes en HPLC
presiones altas
baja resolucin
cambios en tR
Variaciones lnea base
Ruido
Pic falsos
Etc..
Trabajo
Muestras filtradas por ultramicro filtros
Desgasificadas, uso de baos de
ultrasonido.
Uso de reactivos calidad cromatogrficos
Es conveniente uso de precolumnas
Como los detectores no son destructivos, es
posible realizar cromatografas preparativas