PRUEBAS MOLECULARES

Y BIOENSAYO
Milton Drigelio Romero
Codigo: 121003226
Cristhian Garcia
Codigo: 121002812
 PCR CLSICO
Reaccin en cadena de la polimerasa
1985
Kary Mullis y sus companeros de la compaa californiana Cetus
Corporation
Oligonucleotidos. ADN polimerasa I de Escherichia coli y nucleotidos
trifosfatados.
1976 Taq polimerasa Thermus aquaticus. Parque Nacional de
Yellowstone
Obtener in vitro millones de copias de un fragmento de acido
desoxirribonucleico (ADN) a partir de una sola molcula.
Serrato et al. 2008
Serrato et al. 2008
 TCNICA
Reactivos
Muestra de ADN que contenga la region(es) que se desea amplificar
Buffer o solucion amortiguadora
Cloruro de Magnesio (MgCl2)
Desoxirribonucleotidos trifosfato (dNTPs)
Iniciadores
Taq polimerasa
Agua destilada o desionizada esteril

Equipos
Termociclador
Centrifuga
Fase 1: 94c
Fase 2: 45-65c
Fase 3: 72c Castro et al.2011
 CONSIDERACIONES
Los cebadores:
10-24
40-60 GC
Creacin
http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/
Calidad
http://www.thermofisher.com/MultiplePrimerAnalyzer
http://www.premierbiosoft.com
 PCR TIEMPO REAL
La PCR en tiempo real es una tcnica que combina la amplificacin
y la deteccin en un mismo paso, correlacionar el producto de la
PCR de cada uno de los ciclos con una seal de intensidad de
fluorescencia.

Equipos
Fluorometro
Una lmpara (tungsteno), una resistencia (diodo emisor de luz) o un
laser.
520nm 550nm 580nm 610nm 680nm
Aguilera et al.2008
 SISTEMA DE DETECCIN
Fluoroforos con afinidad por el ADN
SYBR Green 520nm
Sondas especificas
Sondas hidrolizadas
Hairpin probes (Molecular Beacons, Scorpions)
Sondas de hibridizacin.
 1
1

1. (SYBR Green)
2. Sondas hidrolizadas

3
3.Hairpin probes

Martnez et al.2004
Sondas de
hibridacin

Martnez et al.2004
PCR TRANSCRIPTASA REVERSA

Martnez et al.2004
 INHIBICIN DE LA
HEMOAGLUTINACIN

GUIA DE TCNICAS INMUNOLGICAS 2010

Caldern Pascacio.2007
 ELISA
Anlisis de inmuno absorcin enzimtica
Principio: determinacin cuantitativa de Ag y Ac por medio de una
molcula indicadora, la cual se encuentra unida covalentemente con una
enzima (conjugado)

Peroxidasa de rbano, glucosa oxidada, catalasa, B galactocidasa, FA.

 DIRECTA
Siempre con control positivo y negativo
Fijacin de Ag especficos al agar. Lavado.
Adicin de anticuerpos marcados (conjugados); si los anticuerpos
reaccionan con los antgenos, el complejo quedar solubilizado. Lavado
Adicin de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima
marcadora.
Lectura visual o colorimtrica del producto final coloreado.
Espectofotometro
INDIRECTA
 TIPO SANDWICH
DAS Fijacin Ac especficos. Lavado (homogeno)
Adicin de la muestra problema (extracto vegetal, sangre, suero, plasma,
etc.
Adicin AC especficos del antgeno a detectar (deben tener un eptopo
diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte) conjugados
con una enzima. Lavado
Adicin de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima
marcadora
 COMPETITIVA
Fijacin Ac especficos. Lavado
Adicin en concentracin conocida de Ag conjugados del Ac utilizado en el paso
anterior y Ag desconocidos objeto de estudio.
Paralelamente, aadir nicamente antgenos del anticuerpo usado en el paso anterior,
marcados con una enzima. Lavar
Adicin de un substrato
Lectura visual o colorimtrica del producto final coloreado de ambas pruebas y
comparar los resultados.
Si las lecturas de ambas pruebas son anlogas, el antgeno a estudio no tienen nada que
ver con los anticuerpos empleados para tapizar el soporte.
Si hay diferencia en las lecturas de ambos pocillos, el antgeno objeto de estudio, est
relacionado serolgicamente con el anticuerpo empleado para tapizar el soporte
la diferencia de densidad ptica, es proporcional a la concentracin del antgeno
problema en la muestra.
BLOQUEANTE
 PASOS GENERALES
1. Tapizado del pocillo con el antgeno o anticuerpo.
2. Adicin de la muestra problema con la mezcla de antgenos o anticuerpos.
3. Unin del antgeno o anticuerpo especfico al anticuerpo o antgeno tapizado en el pocillo
4. Lavado del pocillo para eliminar el exceso de antgeno o anticuerpo no unido
5. Adicin del anticuerpo secundario marcado con la enzima
6. Unin del anticuerpo secundario al antgeno o anticuerpo
7. Lavado del pocillo para eliminar el exceso de enzima no unida
8. Adicin del substrato
9. Unin del substrato a la enzima
10. Desarrollo del color

Todos los tipos de ELISAs descritos se pueden resumir en dos grandes grupos:
ELISAs para detectar antgenos: ELISAs sndwich.
ELISAs para detectar anticuerpos: ELISAs indirectos.
 APLICACIONES
Patologa Animal ; Enfermedades Salmonellas
producidas por parsitos Enfermedad de Aujeszky
Babesias y tripanosomas
Enfermedad de Newcastle
Toxocara canis Fiebre aftosa
Toxoplasmosis Leucemia felina
Triquinosis
Peste porcina africana
Micoplasmas Peste porcina clsica
Mycobacterium tuberculosis Rinotraqueitis infecciosa
Brucelas
Rotavirus
Enterotoxinas Vibrio cholerae Artritis vrica
Estreptococos
 OTROS

Hormonas Gonadotropina corinica, Progesterona,Testosterona,

Hormonas tiroideas
Cuantificacin de inmunoglobulinas IgG, IgE, IgA
Inmunopatologa : Anticuerpos anti-DNA , Factor reumatoide,
Inmunocomplejos circulantes
 IDR
Tecnica simple rapida (24-48h)
Ig G, M y A, c3, c4, transferrina
Ag/Ac en agar
Radio, segn controles.
Sensibilidad, especificidad, avidez
Simple: [Ag], niv protenas.
doble: Ag en centro y 4 perifricos AC especficos ( coggins AIE)
SIMPLE/DOBLE
 HEMOAGLUTINACIN
300 sitios en los cuales se puede adsorber un virus
Elusin es la liberacin del virus. El virus produce elusin sobre el glbulo rojo
a 37 C debido a la destruccin del cido neuramnico en sus
receptores por la neurominidasa del virin
Familia Gnero o especie Eritrocitos

Adenoviridae La mayora de las especies Mono y/o rata, 37C

Poxviridae Ortopoxvirus Pollo, 37C
Parvoviridae La mayora de las especies Cobayo, hmster, cerdo, humano,
mono, 4C.
Ganso, paloma, pollito; pH y
Togaviridae Alfavirus temperaturas crticos.
Flaviviridae Flavivirus Pollito, humano, cobayo, 4C.
Orthomyxoviridae Influenza A Pollito, humano, cobayo, 4C.
Paramyxoviridae Parainfluenza
Enfermedad de Newcastle
Varias especies Rata, ratn, pollito.
Coronaviridae Varias especies Ganso; pH crtico.
Bunyaviridae Rabia Ganso, 4C.
Rhabdoviridae Reovirus Humano
Reoviridae Rotavirus
 Dilusion seriada suero x
Adicion (bac)
Titulacion
tipificacion

pasiva
Cuencas latex/GR conjugados
Acido tnico o cloruro de cromo
Ag de superficie
 BIBLIOGRAFA
PCR: reaccin en cadena de la polimerasa. Alejandra Serrato Diaz, Lluvia Flores
Renteria, Jaime Aportela Cortez, Edgar Sierra Palacios.2008
Tecnologas de marcadores moleculares para estudios de diversidad gentica de
plantas: Mdulo de aprendizaje. IPGRI y Cornell University, 2003
Taq polimerasa: De los geiseres a la ciencia. Joel Cerna Cortes, Jorge Francisco
Cerna Corts. 2013
Reaccin en cadena de la polimerasa (Polymerase Chain Reaction, PCR). Prez de
Castro, Ana Mara.2011
PCR en tiempo real. Penelope Aguilera, Martha Ruiz Tachiquin, Martha Graciela,
Rocha Munive, Benjamin Pineda Olvera.2008
y Maria Elena Chanez Cardenas1
Mtodos fsico-qumicos en biotecnologa, PCR. Cortazar Martnez Adriana, Silva
Rincn Elsa Patricia. 2004
GUIA DE TCNICAS INMUNOLGICAS. 2010
INSTITUTO DE BIOTECNOLOGA. Roco Vanessa Caldern Pascacio.2007
GRACIAS POR SU ATENCIN